膀胱移行細(xì)胞癌組織Livin的表達(dá)及其臨床意義

楊立軍 鄭文武 周安傳 蘇曉哲 吳亞?wèn)| 李珅

·論著·

膀胱移行細(xì)胞癌組織Livin的表達(dá)及其臨床意義

楊立軍 鄭文武 周安傳 蘇曉哲 吳亞?wèn)| 李珅

目的 探討Livin在膀胱移行細(xì)胞癌及癌旁組織中的蛋白表達(dá)水平，分析其與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系及意義，為膀胱移行細(xì)胞癌的診斷及臨床治療提供理論依據(jù)。方法 用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)45例膀胱移行細(xì)胞癌(膀胱轉(zhuǎn)行細(xì)胞癌組)及對(duì)應(yīng)的45例癌旁組織(癌旁組織組)，及10例正常膀胱黏膜移行上皮組織(正常膀胱組)中的Livin蛋白的表達(dá)。結(jié)果 正常膀胱組、膀胱移行細(xì)胞癌組、癌旁組織組Livin表達(dá)陽(yáng)性率分別為0、71.11%、0，其中膀胱移行細(xì)胞癌組陽(yáng)性率均高于正常膀胱組和癌旁組織組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而正常膀胱組和癌旁組織組均未見(jiàn)表達(dá)。Livin表達(dá)與膀胱移行細(xì)胞癌淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)，與腫瘤的分級(jí)有一定關(guān)系；而與患者性別、年齡及臨床分期等指標(biāo)均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。膀胱移行細(xì)胞癌組組織中Livin蛋白表達(dá)陽(yáng)性的凋亡率明顯低于陰性表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論 細(xì)胞凋亡抑制因子Livin在膀胱移行細(xì)胞癌組織中表達(dá)上調(diào)，并且與凋亡率呈負(fù)相關(guān)，提示Livin可能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)膀胱移行細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展起重要作用，有望成為一種有效、敏感的腫腫瘤標(biāo)志物志物，并為膀胱移行細(xì)胞癌的基因治療提供新的靶點(diǎn)。

Livin：膀胱移行細(xì)胞癌：癌旁：蛋白表達(dá)：流式細(xì)胞分析技術(shù)

研究表明，腫瘤發(fā)生是細(xì)胞增殖因子與細(xì)胞凋亡因子失衡所致，受多種因素控制。凋亡抑制蛋白(IAP)是細(xì)胞內(nèi)源性凋亡途徑重要的調(diào)控因子，其既能抑制起始caspase又能抑制執(zhí)行caspase活性的內(nèi)源性蛋白(Crma和p53除外)，其高表達(dá)引起凋亡不足，與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)8個(gè)IAP家族成員(NIAP、cIAP-1、Ciap-2、XIAP、survivin、BRUCE、livin ILP-2)。其中Livin(又稱KIAP.MLIAP)是一種新近發(fā)現(xiàn)的IAP成員，其可以通過(guò)BIR結(jié)構(gòu)域與激活的caspases蛋白結(jié)合，導(dǎo)致后者失活或降解產(chǎn)生抗凋亡作用，還可以通過(guò)選擇性激活JNK1發(fā)揮抗凋亡作用。本文用流式細(xì)胞分析技術(shù)研究Livin在膀胱移行細(xì)胞癌、癌旁組織中的蛋白表達(dá)水平，分析其與臨床生物學(xué)行為的關(guān)系及意義，為膀胱移行細(xì)胞癌的診斷及臨床治療提供理論方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 標(biāo)本取自2012至2013年在我院泌尿外科進(jìn)行外科治療的住院患者，其中膀胱移行細(xì)胞癌45例(膀胱移行細(xì)胞癌組)、對(duì)應(yīng)的癌旁組織45例(癌旁組織組)，正常膀胱黏膜組織10例(正常膀胱組)。膀胱移行細(xì)胞癌組均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)，其中男33例，女12例；年齡26～68歲，平均年齡(50±10)歲；按照WHO病理分級(jí)：G1 12例，G2 20例，G3 13例；TNM臨床分期診斷標(biāo)準(zhǔn)：非浸潤(rùn)性癌(Ta-1期)19例，浸潤(rùn)性癌(T2～4期)26例;單發(fā)24例，多發(fā)21例；初發(fā)29例，復(fù)發(fā)16例；正常膀胱組患者10例均為前列腺增生癥、膀胱結(jié)石的膀胱黏膜組織且經(jīng)病理證實(shí)，其中男7例，女3例；年齡27～69歲，平均年齡(51±9)歲。上述標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑：鼠抗人Livin單克隆抗體(工作濃度1:700)，美國(guó)NEOMARKERS公司；hanks(緩沖液)百浩生物科技有限公司；AlexaFiuor488(異硫氰酸熒光素)Proteintech公司；胃蛋白酶工作液(上海易欣生物科技有限公司)。

1.2.2 儀器:BD FACSEALIBUR流式細(xì)胞儀 BD Bioscience公司(U.S.A)。

1.3 試驗(yàn)方法 應(yīng)用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)。

1.4 試驗(yàn)步驟 在檢測(cè)蛋白免疫熒光標(biāo)記物時(shí)，設(shè)hanks(緩沖液)為陰性對(duì)照，二抗AlexaFiuor488(異硫氰酸熒光素)為陽(yáng)性對(duì)照。具體操作步驟如下：

1.4.1 標(biāo)本蠟塊的處理：在切片機(jī)上將蠟塊包埋的組織切取3～5片40～50 μm厚的組織片。

1.4.2 脫蠟：將切取的組織片放入試管中，用二甲苯5～8 ml(室溫)浸泡2～3 d，其間更換1次或2次二甲苯，脫凈石蠟。

1.4.3 水化：依次用100%、95%、70%、50%濃度的乙醇6～8 ml對(duì)組織進(jìn)行水化，每次水化10～15 min，棄掉乙醇。加入0.9%氯化鈉溶液5～8 ml浸泡30 min，棄掉0.9%氯化鈉溶液。

1.4.4 消化：經(jīng)水化的組織加入0.5%胃蛋白酶(pH值1.5～2)2 ml，置37℃恒溫水浴中，每10分鐘振蕩1次。30 min后，立即加入0.9%氯化鈉溶液終止消化。

1.4.5 過(guò)濾：將消化好的組織放在120目不銹鋼網(wǎng)上，下置一平皿，用眼科剪刀將組織剪碎，用眼科鑷子輕輕搓組織，邊搓邊用0.9%氯化鈉溶液沖洗，直至將組織搓完。將平皿中的混懸液用300目銅網(wǎng)過(guò)濾去掉細(xì)胞團(tuán)塊。

1.4.6 離心：將收集的細(xì)胞懸液離心沉淀，1 500 r/min，4 min，去掉多余懸清液，以0.9%氯化鈉溶液漂洗1次，離心沉淀1 000 r/min，4 min，去掉多余懸清液，再以0.9%氯化鈉溶液漂洗1次，再離心沉淀800 r/min，4 min，去掉多余懸清液，剩約0.5 ml。

1.4.7 標(biāo)抗：將Livin一抗均按1∶50進(jìn)行稀釋。離心后的組織加入Livin抗體工作液0.1 ml，靜置1 h，加入hanks (0.01 mol/L)5～8 ml，離心沉淀800 r/min，4 min，棄懸清液，再加入二抗(AlexaFiuor488)100 μl，2 h 后，加入hanks 5～8 ml，離心同上，除去未結(jié)合的熒光二抗，上機(jī)檢測(cè)。

1.5 結(jié)果評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) Livin蛋白表達(dá)含量以細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度表示，為了使免疫熒光定量分析更加完備，將平均熒光強(qiáng)度換算成熒光指數(shù)(FI)，用FI來(lái)表示Livin在組織中的相對(duì)表達(dá)含量，按照組織細(xì)胞表達(dá)熒光指數(shù)大小對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分類，F(xiàn)I≤1判定表達(dá)量為陰性，F(xiàn)I>1判定為陽(yáng)性。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Livin,Bcl-2陽(yáng)性和陰性表達(dá)細(xì)胞的凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 3組Livin蛋白在膀胱組織中的表達(dá)陽(yáng)性率比較 正常膀胱組、膀胱移行細(xì)胞癌組、癌旁組織組Livin表達(dá)陽(yáng)性率分別為0、71.11%、0，其中膀胱移行細(xì)胞癌組陽(yáng)性率均高于正常膀胱組和癌旁組織組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而正常膀胱組和癌旁組織組均未見(jiàn)表達(dá)。見(jiàn)表1。

表1 3組Livin蛋白在膀胱組織中的表達(dá)陽(yáng)性率比較

注：與正常膀胱組比較，*P<0.05；與膀胱移行細(xì)胞癌比較，#P<0.05

2.2 膀胱移行細(xì)胞癌臨床生物學(xué)行為之間的關(guān)系 Livin表達(dá)在膀胱移行細(xì)胞癌是否有淋巴轉(zhuǎn)移、不同腫瘤分級(jí)間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而在患者不同性別、年齡段及臨床分期等比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 膀胱移行細(xì)胞癌臨床生物學(xué)行為之間的關(guān)系 例(%)

注：與G1比較，*P<0.05；與G2比較，#PM0.05；與有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較，△P<0.05

2.3 Livin蛋白表達(dá)與凋亡率的關(guān)系 膀胱移行細(xì)胞癌組組織中Livin蛋白表達(dá)陽(yáng)性的凋亡率明顯低于陰性表達(dá)(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 膀胱移行細(xì)胞癌組Livin蛋白表達(dá)與凋亡率的關(guān)系 ±s

3 討論

Livin(又稱KIAP.MLIAP) 是新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)IAP家族成員，Ashhab等[1]明確了 Livin基因位于人染色體20q13.3,全長(zhǎng)4.6 kb,包含7個(gè)外顯子?；蜣D(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA長(zhǎng)1.4 kb。Livin蛋白N端僅包含一個(gè)BIR結(jié)構(gòu),C端含一個(gè)RING環(huán)指結(jié)構(gòu)。編碼的Livin蛋白Livinα和Livinβ分別由298和280個(gè)氨基酸組成，Livin氨基酸殘基C124,C127,H44及C151與鋅原子結(jié)合，以穩(wěn)定整個(gè)重疊結(jié)構(gòu)。Livinα和Livinβ蛋白分子量分別為39 000和37 000。Kasof等[2]認(rèn)為L(zhǎng)ivin同時(shí)成絲狀表達(dá)于胞質(zhì)和胞核。其抗細(xì)胞凋亡機(jī)制為(1)抑制Caspase途徑:Livin可與介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的下游效應(yīng)Caspase ,即激活形式的Caspase3和Caspase7結(jié)合,抑制其活性，從而阻斷各種刺激因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程。(2)激活TAK1/JNK1信號(hào)傳導(dǎo)途徑:Livin可激活MAP(mitogen activated protein)激酶JNK1和JNK2,從而抑制細(xì)胞凋亡。TAK1是一上游MAP3激酶,在TGFβ1的刺激下可激活JNK1。TAB1是TAK1的共反應(yīng)子(coactivator),TAB1本身對(duì)于JNK1無(wú)激活作用,但可促進(jìn)TAK1介導(dǎo)的JNK1激活作用。而抑制細(xì)胞凋亡。鑒于Livin具有明顯的抗凋亡作用,人們開(kāi)始日益關(guān)注其與腫瘤發(fā)生及發(fā)展的關(guān)系。

3.1 黑色素瘤 Livin在黑色素細(xì)胞中呈現(xiàn)低水平的表達(dá)，但前者在黑色素瘤中的表達(dá)明顯高于在研究的其他腫瘤表達(dá)水平。Vucic等[3]對(duì)黑色素瘤進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，35株黑色素瘤細(xì)胞系均呈現(xiàn)高表達(dá)水平的Livin mRNA，而正常細(xì)胞未檢出相關(guān)表達(dá)。在黑色素瘤細(xì)胞系Livin基因有兩個(gè)剪接含有298和280個(gè)氨基酸的開(kāi)放閱讀框，均含有桿狀病毒IAP重復(fù)一個(gè)單拷貝的變種(BIR)和環(huán)域，即Livinα和β。Schmollinger等[4]發(fā)現(xiàn)Ⅰ期臨床試驗(yàn)的免疫策略治療播散性黑色素瘤顯示在轉(zhuǎn)移灶中密集的T細(xì)胞和B細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致大量的腫瘤壞死和纖維化。同時(shí)在患者血清中檢測(cè)出高滴度的Livin抗體，表明Livin表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞可被免疫細(xì)胞浸潤(rùn)并殺傷，而在病程進(jìn)展期的患者瘤細(xì)胞Livin表達(dá)低，缺少上述免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)，提示Livin可能與黑色素瘤甚至人某些類型腫瘤的形成存在密切關(guān)系，Livin可能是腫瘤細(xì)胞壞死免疫調(diào)節(jié)的靶點(diǎn)，而其抗原位點(diǎn)的缺失可以導(dǎo)致免疫逃逸。可作為腫瘤免疫治療的一個(gè)有效靶點(diǎn)，Livin的表達(dá)缺失則可使腫瘤實(shí)現(xiàn)免疫逃避。

3.2 肺癌 抗凋亡Livin和Survivin基因在癌細(xì)胞中高表達(dá)和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，但在正常分化組織中幾乎沒(méi)有表達(dá)。然而，沒(méi)有可用的數(shù)據(jù)對(duì)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的表達(dá)。Tanabe等[5]采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)量了Livin mRNA和survivin mRNA表達(dá)，在38例NSCLC癌標(biāo)本和15例非癌肺組織標(biāo)本，在癌基因呈高表達(dá)，而非癌組織(P<0.001)，Livin和Survivin mRNA表達(dá)彼此不相關(guān)。當(dāng)陽(yáng)性截止值是非癌組織中的表達(dá)值，Livin和Survivin mRNA表達(dá)陽(yáng)性率分別為76.3%(29/38)和36.8%(14/38)在肺癌患者和 6.7%(1/15)和0%(0/15)，在非癌肺組織樣本。Livin和Survivin mRNA的表達(dá)在腫瘤23/31上調(diào)(74.2%)早期非小細(xì)胞肺癌患者和11/31(35.5%)。兩基因在腫瘤中的表達(dá)獨(dú)立改變腫瘤組織。這些結(jié)果支持的可能性，Livin基因可能在肺癌的發(fā)展中發(fā)揮作用，Livin mRNA的表達(dá)增加可能成為肺癌治療的新靶點(diǎn)以及Survivin。Hariu等[6]以類似方法檢測(cè)肺腺癌、鱗瘤、大細(xì)胞癌的陽(yáng)性率分別為75%、70%、100%，認(rèn)為L(zhǎng)ivin表達(dá)于大多數(shù)肺癌組織，與腫瘤的組織類型無(wú)關(guān)。鱗癌和腺癌的陽(yáng)性染色均與組織中T細(xì)胞的誘導(dǎo)效應(yīng)呈正相關(guān)。在化療藥物耐受的肺癌細(xì)胞中Livin蛋白表達(dá)水平較高，提示Livin可能作為腫瘤的標(biāo)記物和腫瘤免疫的靶向。孫建國(guó)等[7]在NSCLC進(jìn)一步檢測(cè)到兩種異構(gòu)體均有表達(dá)，但Livin α表達(dá)高于Livinβ。放化治療后組織中Livin表達(dá)陽(yáng)性率顯著升高(43.5%)，在腺癌尤為明顯，推斷在化療藥物和放射線誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的同時(shí)，癌細(xì)胞合成表達(dá)抗凋亡的因子從而發(fā)生凋亡耐受，可能是臨床上肺腺癌發(fā)生耐藥的機(jī)制之一。術(shù)前已有轉(zhuǎn)移的腫瘤組織Livin表達(dá)率(33.3%)高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移者，但因樣本量偏少差異不顯著。結(jié)果顯示，凋亡抑制蛋白Livin在NSCLC表達(dá)，尤其是在肺腺癌患者中表達(dá)較高，不僅可作為肺腺癌的分子標(biāo)志物，還有助于肺癌的診斷和組織分型。

3.3 絨毛膜細(xì)胞癌 Ka等[8]以免疫印跡法和免疫組織化學(xué)法研究了不同時(shí)期的胎盤(pán)、足月孕滋養(yǎng)層細(xì)胞和絨毛膜癌細(xì)胞系:JEG-3(HTB-36)和Jar(HTB-144)。對(duì)早期和晚期妊娠胎盤(pán)各6例用免疫印跡法并未檢測(cè)到Livin表達(dá)，分析可能是Livin在胎盤(pán)中含量不高以及免疫印跡法敏感度較低所致。免疫組織化學(xué)染色得到與陰性對(duì)照明顯不同的陽(yáng)性表達(dá)，且僅僅表達(dá)于胞核。免疫活性蛋白在絨毛的細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、合體滋養(yǎng)層的胞核內(nèi)均可檢測(cè)到，以后者為最低。Livin在絨毛膜癌細(xì)胞中含量比在正常滋養(yǎng)層細(xì)胞中更為豐富。認(rèn)為L(zhǎng)ivin和其他抗凋亡因子一樣，保證了絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞有絲分裂得以完整進(jìn)行，在滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖中起了重要作用。

3.4 消化系惡性腫瘤 Livin在消化系腫瘤患者高表達(dá)，與人消化系腫瘤的發(fā)生存在一定關(guān)系。研究顯示，Livin在胰腺癌AsPC-1株和結(jié)腸癌HT-29的表達(dá)最強(qiáng)，與GAPDH對(duì)照組中mRNA含量之比分別為0.78,0.42[9]。在胰腺癌細(xì)胞MIAPaCa-2和BxPC-3,胃癌細(xì)胞MKN-1以及結(jié)腸癌細(xì)胞LSI180和SW620中無(wú)表達(dá)。另外，對(duì)35例病理確診的胃腸癌患者的血清ELISA檢測(cè)Livin抗體，17例呈陽(yáng)性反應(yīng)，陽(yáng)性率為47%。陽(yáng)性結(jié)果如下:膽管癌5例中3例，胃癌6例中3例，結(jié)腸直腸癌11例中6例，肝癌3例中1例，胰腺癌7例中2例，食管癌3例中2例。15例胃癌患者中6例血清(7例Ⅲ期中4例，2例Ⅳ期中1例，復(fù)發(fā)胃癌1例)與Livin蛋白有反應(yīng)。胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和肝癌細(xì)胞Livin m R NA均過(guò)度表達(dá)，以胃腸癌檢出率相對(duì)較高(47%)，甚至高于抗survivin(40%)，與抗survivin抗體缺少相關(guān)性，表明對(duì)抗體Livin的檢測(cè)可以用作癌癥的檢出，Livin可作為一種新型的癌抗原。

本研究顯示，Livin在膀胱移行細(xì)胞癌中陽(yáng)性表達(dá)率為71.11%,而在正常膀胱黏膜組織及癌旁組織中無(wú)表達(dá)。Livin蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率與BTCC的病理分級(jí)有一定的相關(guān)性,Ⅰ級(jí)與Ⅲ級(jí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說(shuō)明膀胱癌惡性程度越高，Livin陽(yáng)性表達(dá)率越高。非浸潤(rùn)性癌和浸潤(rùn)性癌之間,單發(fā)癌與復(fù)發(fā)癌之間，初發(fā)性癌與復(fù)發(fā)性癌之間，Livin蛋白陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此外，Livin的表達(dá)和臨床特征的關(guān)系結(jié)果表明11例BTCC淋巴轉(zhuǎn)移患者均有Livin的表達(dá)，表明Livin的高表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，同時(shí)與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)。我們?cè)谘芯恐羞€發(fā)現(xiàn)在膀胱移行細(xì)胞癌中，Livin蛋白表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤發(fā)生特點(diǎn)無(wú)關(guān)(P>0.05),這說(shuō)明Livin蛋白表達(dá)可能與上述因素?zé)o相關(guān)性，具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。細(xì)胞凋亡抑制因子Livin在BTCC組織中表達(dá)增加，提示Livin可能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)BTCC的發(fā)生、發(fā)展起重要作用，Livin在膀胱癌中的高表達(dá)有望成為一種有效、敏感的瘤標(biāo)，并為BTCC的基因治療提供新的方向。本研究結(jié)果也說(shuō)明,Livin表達(dá)陽(yáng)性的凋亡率明顯低于陰性表達(dá)，即Livin表達(dá)與凋亡率呈負(fù)相關(guān)，表明Livin參與BTCC的凋亡調(diào)控。Gazzaniga等[10]結(jié)果顯示Livinα和Livinβ在正常膀胱組織中均無(wú)表達(dá),Livinβ在膀胱癌組織中也無(wú)表達(dá),而Livinα表達(dá)陽(yáng)性率為23%。進(jìn)一步分析顯示Livinα表達(dá)陽(yáng)性的患者術(shù)后腫瘤平均復(fù)發(fā)時(shí)間為3.5月,而Livinα表達(dá)陰性的患者則延長(zhǎng)至27.2月,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),提示Livinα表達(dá)與膀胱癌患者治療預(yù)后關(guān)系密切。有文獻(xiàn)報(bào)道以Livin基因?yàn)榘悬c(diǎn)的RNAi技術(shù)可以有效的特異性阻斷內(nèi)源性Livin基因的表達(dá)，使得caspase-3活化，明顯增強(qiáng)各種促凋亡因素(如阿霉素、紫外線照射、TNF-α)導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡率。用Livin基因的反義核酸和Smac肽反向調(diào)節(jié)Livin基因的抗凋亡活性也收到明顯的效果，包括增加化療藥物的促凋亡作用[11，12]。Livin在膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控方面起著顯著作用。其機(jī)制可能是抑制Caspase途徑從而抑制細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但相關(guān)課題研究較少，尚需進(jìn)一步探究。

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10.3969/j.issn.1002-7386.2017.14.013

050051 河北省石家莊市第一醫(yī)院泌尿外科(楊立軍、蘇曉哲、吳亞?wèn)|、李珅)；河北省石家莊市第二醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科(鄭文武)；河北省辛集市中醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合外科(周安傳)

R 737.14

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1002-7386(2017)14-2132-04

2017-02-13)