鹽堿脅迫下堿地膚體內的有機酸積累及其草酸代謝特點

麻瑩，王曉蘋，姜海波，石德成*

(1.長春醫學高等專科學校基礎醫學部，吉林 長春130031；2.東北師范大學國家環境保護濕地生態與植被恢復實驗室，吉林 長春130117；3.東北師范大學生命科學學院，吉林 長春130024)

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鹽堿脅迫下堿地膚體內的有機酸積累及其草酸代謝特點

麻瑩1，2，王曉蘋3，姜海波2，石德成3*

(1.長春醫學高等專科學校基礎醫學部，吉林 長春130031；2.東北師范大學國家環境保護濕地生態與植被恢復實驗室，吉林 長春130117；3.東北師范大學生命科學學院，吉林 長春130024)

本研究對堿地膚幼苗進行鹽脅迫或堿脅迫動態處理，通過分析堿地膚的有機酸含量及草酸代謝相關酶活性等指標，以探討堿地膚的有機酸積累及草酸代謝調控機制的特點。結果表明，隨著堿脅迫時間的延長，堿地膚體內草酸等7種有機酸均有所積累，草酸為主的有機酸的大量積累可能與堿脅迫(高pH)密切相關，它們可能起到離子平衡和pH調節的雙重作用。堿地膚積累的草酸并非主要來源于抗壞血酸分解途徑。此外，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPcase)參與催化的草酰乙酸裂解途徑也不是草酸合成的主要途徑。實驗確定草酸合成的關鍵酶是乙醇酸氧化酶(GO)。草酸分解的草酸氧化酶(OxO)活性高低不是內源草酸積累量的關鍵因子。綜上推斷，堿地膚體內草酸的大量積累與其OxO分解無關，而是主要取決于其合成的GO關鍵酶。

堿地膚; 鹽堿脅迫; 有機酸; 草酸相關酶

資料表明，有機酸不僅具有調節植物細胞Ca2+濃度和pH的作用[1-2]，而且還在植物對缺磷[3]、缺鐵[4]的適應性響應中起著十分重要的作用。有機酸代謝調節在植物抵抗各種逆境脅迫中起重要作用[5]。在植物遭受鋁害時，植物細胞通常積累有機酸或根系分泌有機酸而減輕或避免鋁害[6]。此外，有機酸在植物抵抗鎳、銅、鉛等重金屬脅迫中也起了重要的作用[7]。盡管有關有機酸與逆境脅迫的報道很多，然而有關有機酸與鹽、堿脅迫特別是堿脅迫的報道卻很少。因此，弄清堿地膚(Kochiasieversiana)有機酸積累特點及其相關代謝調節可能是探討其適應鹽、 堿脅迫機理的切入點。

先前的研究已經表明，草酸是藜科植物堿地膚鹽堿脅迫下積累的主要有機酸，它可能就是決定天然抗堿牧草堿地膚既抗鹽又抗堿的重要代謝產物[8]。然而，時至今日鹽堿生境中堿地膚體內草酸的積累途徑還不清楚。如果能弄清其草酸等有機酸積累及草酸代謝途徑特點，將對鹽堿草原的治理、恢復有著極其重要的科學和經濟價值。堿地膚作為一種高度抗鹽堿的藜科牧草，它還具有一定的經濟價值，其全草及種子均可以當作中藥材使用[9]。由于其既具有極強的耐鹽堿能力又具有很好經濟價值，而成為中國東北地區治理堿化草地的首選牧草之一。

土壤鹽漬化已成為限制我國農牧業生產的最大障礙[10]。通常鹽堿化土壤既含有中性鹽(NaCl、Na2SO4)又含有堿性鹽(NaHCO3、Na2CO3)。中性鹽脅迫和堿性鹽脅迫有著本質的不同，它們的脅迫作用機理和植物對其所作出的生理響應也不同[5]。鹽脅迫主要有滲透脅迫和離子脅迫[11]；堿脅迫不僅含有與鹽脅迫相同的脅迫因素，還涉及高pH脅迫[12]。

根據中國東北堿化草地土壤含鹽特點，本研究分別用中性鹽(NaCl、Na2SO4)和堿性鹽(NaHCO3、Na2CO3)模擬出鹽脅迫或堿脅迫條件，并以此對堿地膚幼苗進行脅迫處理[5]。通過動態監測草酸等有機酸及草酸相關酶活性的變化特點，進一步探討有機酸積累特點及草酸特殊的代謝調控機制，為弄清堿地膚適應鹽堿生境特殊的生理機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料培養

堿地膚種子采集于中國吉林省西部天然草原(44°40′-44°45′ N，123°44′-123°47′ E)。播種于直徑17 cm 盛有2.5 kg洗凈細砂的塑料花盆內。出苗后每2 d用1/2 Hoagland 營養液透灌1次，其他時間用蒸餾水補償水分蒸發。每盆定苗16株，試驗期間幼苗數量保持不變。整個實驗于2013年5月中下旬在室外進行，處理期間人工遮雨。

1.2 鹽脅迫和堿脅迫條件

根據中國東北鹽堿化草原土壤所含鹽分的特點，將2種中性鹽NaCl和 Na2SO4以1∶1摩爾比混合作為鹽脅迫組，將2種堿性鹽NaHCO3和Na2CO3以1∶1摩爾比混合作為堿脅迫組[5]。鹽、堿脅迫組的總鹽濃度均為200 mmol/L。這樣保證兩種脅迫處理液的Na+濃度和總離子濃度相同，只有pH不同，而且堿脅迫組溶液的pH值與典型的堿地膚生境的pH值相近(9.80～10.10)[8]。以不含脅迫鹽的Hoagland營養液作為對照。鹽脅迫組、堿脅迫組和對照組溶液的pH分別是6.58，9.96及6.56。

1.3 脅迫處理

苗齡6周后，選取66盆長勢一致的堿地膚苗，隨機分為22組，每組3盆為3次重復。其中8組為只澆營養液在不同時間點(0、16、24、36、48、72、96、144 h)取樣的對照組(CK)。另外7組為用中性鹽處理不同時間(16、24、36、48、72、96、144 h)取樣的鹽脅迫組。其余7組為用堿性鹽處理不同時間(時間點同中性鹽組)取樣的堿脅迫組。含有相應濃度脅迫鹽的營養液作為處理液，每盆用500 mL處理液透灌，每天2次(早7：00和晚6：00)，使植株處于完全脅迫狀態；對照組只澆500 mL營養液。試驗重復3次[5]。

1.4 取樣

分別按不同處理時間(0、16、24、36、48、72、96和144 h)逐盆取出堿地膚植株，先沖洗干凈其根部；之后分別用自來水、蒸餾水沖洗植株，再用濾紙吸干植株表面水分。在子葉痕處剪開，將植株分成莖葉和根2個部分，分別稱取2個部分的鮮重(fresh weight, FW)。分別稱取0.2 g新鮮成熟葉片，用于草酸相關酶活性測定。分別稱取5 g莖葉部分凍干，用于草酸等有機酸的含量測定。其余鮮樣85 ℃，殺青15 min后，40 ℃下真空干燥至恒重，記錄干重(dry weight, DW)。

1.5 生理指標測定

1.5.1 草酸等有機酸含量測定 分別稱取以上100 mg凍干樣品，10 mL無離子水分多次加入研磨提取，3000 r/min，離心10 min，收集上清液，反復3次合并上清液并用無離子水定容至50 mL，用于草酸等有機酸含量測定。

草酸等有機酸(除總抗壞血酸外)用離子色譜法測定(美國戴安公司生產DX-300離子色譜系統，CDM-II電導檢測器)；其中草酸的測定用 AS4A—SC離子交換柱，流動相為Na2CO3/NaHCO3=1.7/1.8 mmol/L，其他有機酸則用ICE-AS6離子排斥柱，加AMMS-ICE Ⅱ消聲器，流動相為0.4 mmol/L 全氟丁酸。總抗壞血酸測定采用2，4-二硝基苯肼法參照國標[13]。

1.5.2 酶活性測定 分別稱取葉片0.2 g，加入2 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液 (5 mmol/L MgCl2，0.1% Triton X-100，10% 丙三醇，5 mmol/L EDTA，pH 7.5)，在冰上充分研磨成勻漿后，4 ℃下15000 r/min離心5 min，上清液即為酶提取液，備用。

乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase, GO: EC 1.1.3.1)參照Booker等[14]方法加以修改。1 mL的反應液中含有Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L，pH 7.8)，鹽酸苯肼(10 mmol/L，pH 6.8)，0.1 mL酶液，搖勻，水浴30 ℃保溫10 min，加入0.1 mL 乙醇酸(用KOH調至pH 7.0)啟動反應。室溫反應1 min后，連續2 min記錄324 nm處吸光值的升幅。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPcase: EC 4.1.1.31)活性參照Yang等[15]方法加以修改。1 mL反應液包含：Tris-HCl(100 mmol/L，pH 8.4)，100 mmol/L NaHCO3，25 mmol/L 磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate, PEP)，5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L NADH，2U蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase, MDH)混勻，30 ℃水浴10 min，加入酶液啟動反應。室溫下連續3 min記錄340 nm處吸收值的降幅。

異檸檬酸裂解酶(isocitrate lyase, ICL: EC 4.1.3.1)活性測定參照Brock等[16]方法加以修改。1 mL反應液中包含：2 mmol/L 二硫蘇糖醇，2 mmol/L 異檸檬酸鉀，2 mmol/L MgCl2，10 mmol/L 鹽酸苯肼，50 mmol/L KH2PO4(pH 7.0)。搖勻，25 ℃保溫10 min，用酶液啟動反應，1 min后連續記錄3 min內324 nm處吸收值的升幅。

草酸氧化酶(oxalate oxidase, OxO: EC 1.2.3.4)活性測定參照Thakur等[17]方法加以修改。2 mL反應液：80 μmol琥珀酸鈉(pH 5.0)，1 μmol CuSO2，1 mmol/L 草酸和酶液。40 ℃反應5 min后，加入1.0 mL顯色試劑(0.4 mol/L磷酸鈉緩沖液，pH 7.0；每100 mL顯色劑包含100 mg 苯酚，50 mg 4-氨基吡啉，1 mg 辣根過氧化酶)，在室溫黑暗中反應15 min，記錄波長520 nm處的吸光值，參照H2O2標準曲線計算H2O2含量。

以上酶活性測定以不加酶液作空白對照。酶提取液的蛋白質含量采用Bradford (1976)[18]方法測定。酶活性用1 mg酶蛋白1 min內生成產物或消耗底物的nmol或μmol數量表示。

1.6 數據處理

用 Excel作圖，數據處理及方差分析等采用SPSS 13.0程序完成。所有數據均用3次重復數據的平均值及其標準誤(S.E.)表示，檢驗水平為P<0.05。采用 LSD法在0.05水平上進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 鹽、堿脅迫對堿地膚莖葉草酸等有機酸含量的影響

表1分別顯示了在鹽、堿脅迫下堿地膚莖葉的草酸等有機酸的含量變化情況。在非脅迫條件下，草酸含量并無明顯變化(P>0.05)；而隨著鹽、堿脅迫時間的延長，草酸含量均顯著升高(P<0.05)，堿脅迫下，草酸最大積累量是對照(0 h)的3.02倍，而鹽脅迫下，其最大值是對照(0 h)的1.28倍，可見，鹽、堿脅迫均不同程度地促進草酸的積累，而堿脅迫對它的積累作用更大。

表1 鹽、堿脅迫對堿地膚莖葉有機酸含量的影響Table 1 Effects of salt and alkali stresses on the organic acid content in the shoots of K. sieversiana μmol/g FW

注：用200 mmol/L中性鹽(NaCl∶Na2SO4=1∶1; pH 6.58)和200 mmol/L堿性鹽(NaHCO3∶Na2CO3=1∶1; pH 9.96)處理苗齡6周的堿地膚0～144 h。表中數據均為3次測定的平均值±SE。同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Six-week-old seedlings ofK.sieversianawere treated with salt (NaCl∶Na2SO4=1∶1; 200 mmol/L; pH 6.58) and alkali (NaHCO3∶Na2CO3=1∶1; 200 mmol/L; pH 9.96) stresses for 0-144 h. Data in the table are the average of three determinations (±SE). Different letters within the same column show significant difference (P<0.05).

在非脅迫條件下，蘋果酸是僅次于草酸的第二大有機酸(表1)。鹽脅迫對蘋果酸的含量影響不大(P>0.05)；而堿脅迫處理24 h后，其含量驟然增加(P<0.01)，脅迫96 h時其含量達到頂峰(其含量是0 h的14.3倍)。

從表1可以看出，隨著鹽、堿處理時間的延長，檸檬酸含量均顯著升高(P<0.01)，且堿處理 (F=37.13)的影響明顯大于鹽處理(F=5.75)，然而檸檬酸的最大積累量僅為草酸最大積累量的17.09%。可見，檸檬酸的作用也遠不及草酸。

在非脅迫條件下，抗壞血酸的含量隨著時間的延長略有升高的趨勢(P<0.05)，經鹽、堿脅迫(脅迫16 h)的抗壞血酸含量表現出暫時性的升高。值得注意的是，在持續96和144 h的堿脅迫下抗壞血酸含量有所下降。這可能與長時間的堿性環境加速其氧化分解有關。但在整個脅迫過程中，堿脅迫處理的含量始終高于鹽脅迫。

非處理組莖葉部分甲酸、乙酸、琥珀酸含量極低(分別占干重的0.03%，0.10%，0.06%)。鹽脅迫下，它們的含量變化不大(P>0.05)。隨著堿脅迫處理時間的延長，三者含量均顯著升高(P<0.05)。

從表1整體來看，鹽堿脅迫下有機酸的積累量為草酸>蘋果酸>檸檬酸，其中草酸是積累最主要的有機酸(其含量占總有機酸含量的60.47%～94.36%)，而甲酸、乙酸、琥珀酸、抗壞血酸等有機酸的積累量并不大，其總量為總有機酸的3.83%～6.43%。可見，甲酸、乙酸、琥珀酸、抗壞血酸等有機酸在堿地膚適應鹽堿脅迫的過程中作用甚微。

2.2 鹽、堿脅迫對堿地膚葉片中草酸代謝相關酶活性的影響

從圖1A可知，鹽、堿2種脅迫下堿地膚成熟葉片的GO活性均隨脅迫時間的延長呈整體上升的趨勢。當鹽、堿脅迫時間低于24 h，GO活性變化不明顯(P>0.05)；而脅迫時間超過24 h，GO活性均明顯升高(P<0.01)，鹽、堿脅迫下GO活性最大值分別是對照的1.37和1.84倍，可見，只有鹽、堿脅迫時間超過24 h，才會激活GO活性，而堿脅迫下對其激活程度更大。

圖1 鹽、堿脅迫對堿地膚葉片乙醇酸氧化酶(GO)、異檸檬酸裂解酶(ICL)、磷酸烯醇式 丙酮酸羧化酶(PEPcase)、草酸氧化酶(OxO)活性的影響Fig.1 Effects of salt and alkali stresses on the activities of GO, ICL, PEPcase and OxO in the leaves of K. sieversiana 同一曲線上不同字母表示差異顯著(P<0.05)。Different letters on the same curve show significant difference (P<0.05).

如圖1B所示，與GO相同，鹽、堿脅迫處理下ICL活性均隨脅迫時間增加而顯著上升(P<0.01)，堿脅迫的升幅高于鹽脅迫，而其特殊之處在于其酶活性急劇上升(P<0.01)的時間發生在24和36 h之間，繼續增加鹽、堿脅迫處理時間，ICL活性升高幅度均不大(鹽處理：P>0.05，堿處理：0.01

從圖1C可知，鹽、堿處理使葉片PEPcase活性升高。24 h以內的鹽、堿脅迫對PEPcase活性均無顯著影響(P>0.05)；而鹽堿脅迫時間超過24 h，其活性均顯著增加(P<0.01)，鹽、堿脅迫下其酶活性最大值分別是對照的3.95和1.62倍。可見，鹽脅迫比堿脅迫更促進PEPcase酶活性的升高。

如圖1D可知，鹽、堿處理初期(脅迫16 h)葉片中OxO活性均升高，但隨鹽、堿脅迫時間增加其活性隨之降低，特別是脅迫超過24 h后其活性急劇下降。在144 h達到最低，他們分別是對照的39.20%和50.56%，可見，與堿脅迫相比，鹽脅迫處理對OxO活性的抑制作用更強。

3 討論

植物可通過調節自身的生命活動過程來適應鹽堿脅迫，植物在其生長過程中不斷地積累無機離子及有機化合物，這是植物長期適應鹽堿生境而形成的一種適應機制。對于高度抗鹽堿牧草堿地膚來說，有機酸可能就是決定其既抗鹽又抗堿的重要代謝產物[5]。而堿地膚莖葉的草酸在總有機酸中占有絕對優勢的地位(60.47%～94.36%)，因此，草酸是堿地膚莖葉中的主要有機酸，也是鹽、堿脅迫下主要積累的有機酸。本實驗中隨著堿脅迫處理時間的延長，堿地膚體內草酸等7種有機酸含量均明顯增加。草酸為主的有機酸的大量積累可能起到離子平衡和pH調節的雙重作用[19]。

蘋果酸與許多植物的抗逆作用有關[20]，在很多植物中，鹽脅迫可誘導蘋果酸酶基因的表達和蘋果酸酶蛋白的積累[21]，而本實驗中蘋果酸僅在堿脅迫下積累量劇增(表1)。除草酸以外，蘋果酸是堿地膚響應堿脅迫積累的第二大有機酸，可見，蘋果酸在堿地膚響應堿脅迫過程中也起到一定的作用。

體內積累有機酸可能是星星草(Puccinelliatenuiflora)[22]、堿地膚[5]等植物適應堿脅迫維持細胞內離子平衡及調節pH的有效途徑。禾本科植物星星草僅在堿脅迫下特異性積累檸檬酸，且檸檬酸是星星草積累的主要有機酸[22]。而本實驗中隨著鹽、堿處理時間的延長，堿地膚的檸檬酸積累量明顯增加，堿處理的積累量遠高于鹽處理；而檸檬酸的積累量也遠不及草酸(表1)。此外，在鹽堿生境下，禾本科的虎尾草(Chlorisvirgata)體內蘋果酸的積累量最大，其在虎尾草響應鹽堿脅迫中的作用不可忽視[23]。綜上可知，在不同植物中，有機酸響應鹽、堿脅迫的積累特點不盡相同。

草酸就是堿地膚莖葉中決定其適應鹽堿生境的關鍵物質；鹽堿脅迫下堿地膚的草酸主要分布在成熟的功能葉片中[5]。葉片也是植物合成草酸的主要場所[24]，但其合成途徑尚不完全清楚。本實驗測定了成熟葉片中草酸代謝相關酶的活性。

GO既能催化乙醇酸氧化生成乙醛酸，還可繼續催化乙醛酸生成草酸。而ICL可催化異檸檬酸裂解，其產物之一為乙醛酸[25]，后者又在GO催化下氧化生成草酸。在外施鹽、堿脅迫24 h后，GO，ICL的活性均顯著升高(P<0.01)，尤其以堿脅迫更為突出。相關分析表明，葉片中GO和ICL酶活性與莖葉部分草酸含量均為正相關關系。但前者的相關度(r=0.739)大于后者(r=0.549)。因此可以說，GO可能在植物合成草酸過程中起著更為重要的作用。這與以往的報道一致[24]。

在許多植物中抗壞血酸分子可裂解后生成草酸和酒石酸[1]，但其生化機制尚不十分清楚。鹽、堿脅迫條件下，堿地膚植株各部分均未檢測到酒石酸的存在[8]，而且堿地膚草酸含量變化與抗壞血酸的變化不存在顯著負相關(鹽、堿脅迫下其相關系數r分別為0.483和-0.095) 。此外，堿地膚莖葉中抗壞血酸含量很低，其不足草酸的2%。綜上，堿地膚利用抗壞血酸形成草酸的可能性較小。抗壞血酸分解代謝途徑并非其草酸積累的主要來源，這與以往的報道不一致[1]。

同位素示蹤的方法表明草酰乙酸是草酸形成的前體[24]，在C4植物中，PEP在PEPcase的催化下，羧化生成草酰乙酸。而后者可在草酰乙酸裂解酶的催化下分解生成草酸[26]。而本實驗堿地膚莖葉部分草酸含量與葉片PEPcase活性之間成負相關(r=-0.208)。另外蘋果酸也是草酸的合成前體[24]，莖葉部分草酸含量與蘋果酸含量成顯著正相關(r=0.931)，這與Libert等[24]發現的大黃(Rheumofficinale)葉柄中二者含量呈負相關的結果正好相反。綜上，可排除堿地膚體內的草酰乙酸或蘋果酸是草酸前體的可能。

越來越多的證據表明草酸并不是植物中的一種代謝終產物，它能繼續被降解生成 CO2[27]，而OxO可能是植物體內最重要的草酸降解酶。鹽、堿脅迫抑制OxO活性，且鹽脅迫對OxO活性的抑制大于堿脅迫(圖1D)，即鹽處理下的草酸分解速率小于堿處理，而鹽脅迫下莖葉部分的草酸含量遠遠低于堿脅迫下(圖1A)。此外，草酸含量與OxO活性之間有很小的負相關(r=-0.234)。通過以上事實推斷，OxO活性高低即草酸分解作用并不是內源草酸積累量的限制因子，決定草酸積累的主導因素主要是由GO關鍵酶催化的草酸的合成途徑。通過以上事實推斷，堿地膚體內草酸的大量積累與其OxO分解無關，而是主要取決于其合成作用，GO又是決定草酸合成的關鍵酶。

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Characteristics of organic acids accumulation and oxalate metabolism inKochiasieversianaunder salt and alkali stresses

MA Ying1,2, WANG Xiao-Ping3, JIANG Hai-Bo2, SHI De-Cheng3*

1.DepartmentofBasicMedicine,ChangchunMedicalCollege,Changchun130031,China; 2.StateEnvironmentProtectionKeyLaboratoryofWetlandEcologyandVegetationRestoration,NortheastNormalUniversity,Changchun130117,China; 3.SchoolofLifeSciences,NortheastNormalUniversity,Changchun130024,China

In this study, seedlings ofKochiasieversianawere subjected to different salt and alkali stresses. The characteristics of organic acid accumulation and mechanisms regulating oxalate (OXA) metabolism were investigated by quantifying various organic acids and determining the activities of OXA metabolism-related enzymes. Seven kinds of organic acids (including OXA) accumulated inK.sieversianaunder extended alkali stress. The accumulation of these organic acids was correlated with alkali stress (high pH), suggesting that they play roles in ion balance and pH regulation. The degradation pathway of L-ascorbic acid was not the main source of OXA. The cleavage of oxaloacetate by phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPcase) probably played a minor role in OXA synthesis, but glycolate oxidase (GO) was the key enzyme for OXA synthesis. The activity of oxalate oxidase (OxO) involved in OXA decomposition was not a limiting factor for endogenous OXA accumulation. Taken together, these results showed that OXA accumulation inK.sieversianaunder alkali stress was not because of reduced OXA degradation by OxO, but largely depended on OXA synthesis by GO.

Kochiasieversiana; salt/alkali stresses; organic acid; oxalate-metabolizing enzyme

10.11686/cyxb2016365

2016-09-27；改回日期：2016-12-05

國家自然科學基金資助項目(41271231),東北師范大學教育部重點實驗室開放課題(130028691)和吉林省教育廳項目(JJKH20171071KJ)資助。

麻瑩(1981-)，女，內蒙古呼倫貝爾人，副教授，博士。E-mail：may635@nenu.edu.cn

*通信作者Corresponding author. E-mail：shidc274@nenu.edu.cn

http://cyxb.lzu.edu.cn

麻瑩, 王曉蘋, 姜海波, 石德成. 鹽堿脅迫下堿地膚體內的有機酸積累及其草酸代謝特點. 草業學報, 2017, 26(7): 158-165.

MA Ying, WANG Xiao-Ping, JIANG Hai-Bo, SHI De-Cheng. Characteristics of organic acids accumulation and oxalate metabolism inKochiasieversianaunder salt and alkali stresses. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(7): 158-165.