急性冠脈綜合征病人microRNA-499水平變化的影響

魏 瑋，賈永平

急性冠脈綜合征病人microRNA-499水平變化的影響

魏 瑋1，賈永平2

目的 探討循環(huán)microRNA-499在急性冠脈綜合征病人表達(dá)水平的變化及其與冠脈狹窄程度的關(guān)系。方法 選擇2015年1月—2015年8月山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院心內(nèi)科病人60例，均為以典型胸痛癥狀，首次就診高度懷疑冠心病并行冠脈造影的病人。根據(jù)心電圖變化、血心肌肌鈣蛋白I(cTnI)水平、冠脈造影結(jié)果分為無(wú)冠心病(No-CAD)組(n=20)、不穩(wěn)定型心絞痛(UA)組(n=20)、急性心肌梗死(AMI)組(n=20)。受試者于入院后次日清晨空腹抽取肘靜脈血5 mL，EDTA抗凝，1 h內(nèi)分離血漿并于-80 ℃凍存。采用SYBR法qrt-PCR檢測(cè)血漿microRNA-499水平。所有病人在住院期間行冠脈造影術(shù)并根據(jù)造影結(jié)果進(jìn)行Gensini評(píng)分。結(jié)果 3組病人基本資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與No-CAD組及UA組比較，AMI組病人血漿miR-499水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。AMI組microRNA-499水平與cTnI、N末端B型腦鈉肽前體(NT-proBNP)、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)水平呈正相關(guān)，與Gensini積分無(wú)相關(guān)性。結(jié)論 心肌損傷時(shí)microRNA-499由心肌細(xì)胞釋放進(jìn)入血循環(huán)，可作為急性心肌梗死的檢測(cè)指標(biāo)。

急性冠脈綜合征；循環(huán)microRNA-499；冠脈狹窄程度

中國(guó)心血管病患病率處于持續(xù)上升階段，2014年中國(guó)心血管病死亡率仍居于疾病死亡構(gòu)成的首位，高于腫瘤及其他疾病[1]。目前對(duì)冠心病的識(shí)別主要有以下兩種方法，其一是高分辨率影像學(xué)成像技術(shù)，包括：64排CT和冠脈造影，二者均是診斷冠心病的強(qiáng)有力證據(jù)，但由于其費(fèi)用昂貴、操作有創(chuàng)性等特點(diǎn)，不能普遍使用；其二，循環(huán)血生化標(biāo)志物的檢測(cè)，主要包括：血心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、肌酸激酶(CK-MB)、N末端B型腦鈉肽前體(NT-proBNP)等，已廣泛運(yùn)用，但對(duì)心血管事件發(fā)生的預(yù)測(cè)及判斷預(yù)后價(jià)值有限。近年來(lái)，隨著RNA組學(xué)研究旳進(jìn)展，人們發(fā)現(xiàn)microRNA(miRNA)是一種可用于心血管疾病診斷的新的標(biāo)志物。

miRNA是內(nèi)源性、高度保守的單鏈非編碼小RNA，在轉(zhuǎn)錄后通過降解靶基因或抑制蛋白質(zhì)合成對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[2]。很多研究表明，人體循環(huán)血液中的miRNAs(即循環(huán)miRs)有顯著的穩(wěn)定性及高度的心血管疾病特異性，可很好的被分離及檢測(cè)。本研究的miR-499是肌細(xì)胞特異的miRNA，可由心肌細(xì)胞及骨骼肌細(xì)胞產(chǎn)生，但以心肌細(xì)胞為主[3]。也有研究表明，miR-499是在心肌梗死過程中由心肌細(xì)胞釋放的[4]。本研究旨在探討循環(huán)miR-499在急性冠脈綜合征病人表達(dá)水平的變化及其與冠脈狹窄程度的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象與分組 選擇2015年1月—2015年8月于山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院心內(nèi)科住院病人60例，均為以典型胸痛癥狀首次就診的疑似急性冠脈綜合征，并行冠脈造影病人，男45例(75%)，女15例(25%)。根據(jù)心電圖變化、冠脈造影結(jié)果、血心肌肌鈣蛋白I水平分為3組，無(wú)冠心病(No-CAD)組(n=20)：即心電圖ST-T無(wú)特異性改變、cTnI<0.1 μg/L、冠脈造影無(wú)明顯病變，排除冠心病診斷；不穩(wěn)定型心絞痛(UA)組(n=20)：即心電圖ST-T升高或降低≥0.1 mV、cTnI無(wú)明顯升高、冠脈造影明確冠心病診斷。急性心肌梗死(AMI)組(n=20)：即心電圖ST-T動(dòng)態(tài)演變、cTnI>0.1 μg/L，冠脈造影明確冠心病診斷。排除對(duì)象：既往心肌梗死、心臟搭橋病史；既往腦卒中病史；嚴(yán)重感染、炎癥性疾病；任何腫瘤；肝腎功能不全、心功能不全；心臟瓣膜病；擴(kuò)張型心肌病。本試驗(yàn)嚴(yán)格遵守赫爾辛基宣言條款，并獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)通過。所有病人或病人法定監(jiān)護(hù)人均充分了解本試驗(yàn)并簽署知情同意書。

1.2 試驗(yàn)方法 心電圖檢查：胸痛時(shí)ST段抬高或下移>0.1 mV伴或不伴T波改變即為心電圖陽(yáng)性。生物學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)：所有病人入院后即可抽血化驗(yàn)cTnI，cTnI>0.1 μg/L為陽(yáng)性，診斷為急性心肌梗死；同時(shí)化驗(yàn)NT-proBNP、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)。入院次日清晨空腹抽取肘靜脈血5 mL，EDTA抗凝，1 h內(nèi)分離血漿并于-80 ℃凍存。用miRNeasy Plasma Kit(凱杰，德國(guó))提取血漿總RNA。向200 μL使用EDTA抗凝的血漿中加入1 000 μL QIAzol試劑，室溫靜置5 min。向混合液中加入3.5 μL 1.6×108Caenorhabditis elegans miR-39(cel-miR-39)，用來(lái)標(biāo)化miRNA。充分混勻后，加入200 μL氯仿充分震蕩15 s，室溫靜置2 min～3 min。之后在4 ℃環(huán)境下12 000 g離心15 min。總RNA用miScript Reverse Transcription kit(凱杰)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，按照說明書建立20 μL的體系，37 ℃孵育60 min、95 ℃反應(yīng)5 min。獲得的cDNA稀釋后使用miScript SYBR Green PCR kit(凱杰)進(jìn)行PCR，按照說明書建立25 μL體系，95 ℃孵育15 min后進(jìn)行40次循環(huán)的三步反應(yīng)(94 ℃變性15 s、55 ℃退火30 s、70 ℃擴(kuò)增30 s)。循環(huán)miR-499表達(dá)水平用2-△△CT表示，即2-[(CT miR-499 -CT cel-miR-39)疾病組-(CT miR-499 -CT cel-miR-39)對(duì)照組]。根據(jù)以上公式，No-CAD組的“-△△CT”值為0，即設(shè)定No-CAD組miR-499水平為標(biāo)準(zhǔn)值“1”。冠脈造影：所有病人住院期間行冠脈造影術(shù)并根據(jù)造影結(jié)果進(jìn)行Gensini評(píng)分。選用8支主要的血管(左主干、前降支近段、前降支中段、第一對(duì)角支、回旋支近段、回旋支中段、右冠脈近段、右冠脈中段共8支血管，若間隔支、第二對(duì)角支、鈍緣支及前降支遠(yuǎn)段中任一血管的直徑超過上述8支血管中的任一血管，即用該支血管取代直徑較小的血管)血管評(píng)分：所選血管按其最狹窄處評(píng)分，狹窄程度≤25%計(jì)1分；26%～50%計(jì)2分；51%～75%計(jì)4分；76%～90%計(jì)8分；91%～99%計(jì)16分；100%(完全閉塞)計(jì)32分；不同節(jié)段再乘以相應(yīng)系數(shù)：左主干×5，左前降支或回旋支近段×2.5，左前降支中段×1.5，左前降支遠(yuǎn)段×1.0，左回旋支中、遠(yuǎn)段×1.0，右冠狀動(dòng)脈×1.0，小分支×0.5最后總分為8支血管記分的總分，若一支血管段多處狹窄，即以該段血管最狹窄處計(jì)分。

2 結(jié) 果

2.1 3組基線資料比較 3組間cTnI、NT-proBNP、hs-CRP比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩兩比較后發(fā)現(xiàn)no-CAD組與UA組總體均值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，AMI組分別與no-CAD組和UA組總體均值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，AMI組cTnI、NT-proBNP、hs-CRP水平高于UA組及no-CAD組；3組間ACEI類藥物的使用率明顯不同。詳見表1。

表1 3組受試者基線資料比較

2.2 循環(huán)miR-499水平比較 循環(huán)miR-499水平用2-△△CT表示，設(shè)定no-CAD組miR-499水平為標(biāo)準(zhǔn)值“1”。與no-CAD組相比較，UA組miR-499水平升高差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在AMI組miR-499顯著高于UA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見表2。

表2 循環(huán)miR-499水平比較(±s)

2.3 AMI組miR-499水平與cTnI、NT-proBNP、hs-CRP的相關(guān)性分析 3組受試者基線資料中cTnI、NT-proBNP、hs-CRP水平在AMI組均升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)而對(duì)這3個(gè)指標(biāo)與AMI組miR-499水平進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示：AMI組miR-499水平與cTnI(r=0.498，P=0.025)、NT-proBNP(r=0.485，P=0.030)、hs-CRP(r=0.515，P=0.020)均呈正相關(guān)關(guān)系。

2.4 AMI組miR-499水平與冠脈狹窄程度的相關(guān)性分析 經(jīng)冠脈造影診斷為冠心病病人，根據(jù)冠脈造影結(jié)果計(jì)算Gensini評(píng)分。在AMI組，將其循環(huán)miR-499濃度與Gensini評(píng)分進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示：循環(huán)miR-499水平與Gensini評(píng)分無(wú)相關(guān)性(P=0.540)。

3 討 論

本研究并未采用健康人群作為對(duì)照組，而是以胸痛就診、需要行冠脈造影但最終由冠脈造影排除冠心病病人作為對(duì)照組，考慮原因有：一方面由于不符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)的要求，另一方面，引入無(wú)冠心病病人也排除不穩(wěn)定型心絞痛本身會(huì)引起循環(huán)miR-499水平降低的可能性，這使得AMI組與UA組間的差異更有意義。

傳統(tǒng)急性心肌梗死診斷標(biāo)志物，如CK-MB、cTnI等雖已被廣泛運(yùn)用，但它們反應(yīng)性升高時(shí)間長(zhǎng)、半衰期長(zhǎng)等特點(diǎn)，不利于急性心肌梗死的早期診斷及再梗死的早期識(shí)別。因此，需要新的診斷性標(biāo)志物。急性心肌梗死的診斷標(biāo)志物，應(yīng)具有如下特點(diǎn)[5-8]：應(yīng)特異性表達(dá)于心肌組織；其在未發(fā)生心肌壞死時(shí)，它在血循環(huán)的濃度是極低的，甚至是檢測(cè)不到的；在發(fā)生急性心肌梗死時(shí)，血液中濃度應(yīng)迅速且顯著升高。近年來(lái)許多研究表明，循環(huán)microRNA可作為心血管疾病診斷的新的血生化標(biāo)志物。

本研究所涉及的miR-499是心肌細(xì)胞特異的循環(huán)microRNA。Adachi等[2]發(fā)現(xiàn)，miR-499水平在心肌梗死后6 h、12 h顯著升高。Devaux等[9]發(fā)現(xiàn)，miR-499水平在急性心肌梗死病人發(fā)生胸痛后3 h顯著升高，并且與hs-cTnT呈正相關(guān)。本研究證實(shí)心肌細(xì)胞相關(guān)的miR-499可較好分離和檢測(cè)。AMI組miR-499水平顯著高于UA組及對(duì)照組。因此循環(huán)miR-499水平可作為急性心肌梗死診斷的新的血生化標(biāo)志物，指導(dǎo)臨床急性心肌梗死的診斷及與其他急性冠脈綜合征的鑒別診斷。在急性心肌梗死的病人循環(huán)miR-499水平與以往診斷急性心肌梗死及反映心臟功能的一些指標(biāo)(如：cTnI、NT-proBNP、hs-CRP)相關(guān)，今后可將這些指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用，可快速、有效的診斷疾病、判斷預(yù)后。

本研究中AMI組miR-499水平與Gensini積分無(wú)相關(guān)性，miR-499不能反映急性冠脈綜合征病人冠脈狹窄程度。這可能由于Gensini評(píng)分自身特點(diǎn)決定。臨床上，Gensini評(píng)分越高，表示冠脈病變嚴(yán)重程度越重，多支血管狹窄甚至完全閉塞得分通常較單支血管高。而miR-499水平與壞死心肌的范圍相關(guān)，主干血管單支狹窄較重，甚至完全閉塞會(huì)引起心肌大面積壞死，此時(shí)miR-499水平較高。而多支小血管病變時(shí)，Gensini積分雖高，但由于心肌細(xì)胞壞死范圍小，故miR-499水平并不是很高。具體原因有待今后進(jìn)一步研究證實(shí)。

關(guān)于標(biāo)化物的選擇，引入cel-miR-39，這是由于很多研究表明一些常用的內(nèi)參基因，如U6在血漿和血清中是不存在的。通常策略是用一些已被證實(shí)在組織或細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的miRNA作標(biāo)化，如：miR-191[10]、miR-16[11]、let-7a[12]。然而在不同實(shí)驗(yàn)環(huán)境下不能確保相同表達(dá)[13]；相比之下，完全不相關(guān)的cel-miR-39不僅可監(jiān)控RNA純化和逆轉(zhuǎn)錄效率，還可作為標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照使用[14]，因此采用凱杰公司提供的cel-miR-39作為循環(huán)miR-499的標(biāo)化物。

本研究不足處有，沒有對(duì)循環(huán)miR-499失調(diào)的分子機(jī)制進(jìn)行研究，循環(huán)miRNAs水平變化可能受到多種因素影響，如細(xì)胞破裂釋放、疾病所引起的miRNAs表達(dá)失調(diào)等。仍需要進(jìn)一步的研究來(lái)闡述這些miRNAs變化的機(jī)制。

分析循環(huán)miR-499水平與冠脈狹窄程度的關(guān)系。對(duì)前期有關(guān)miR-499表達(dá)水平的研究進(jìn)行驗(yàn)證。循環(huán)miRNAs水平變化的機(jī)制及這些循環(huán)miRNAs水平的變化對(duì)冠心病病理、生理過程的影響仍需要進(jìn)一步研究。

[1] 胡盛壽，高潤(rùn)霖，劉力生.中國(guó)心血管病報(bào)告2015[J].中國(guó)循證雜志，2015，30(7)：617-622.

[2] Baek D，Ville’n J，Shin C，et al.The impact of microRNAs on protein output[J].Nature，2008，455(7209)：64-71.

[3] Adachi T，Nakanishi M，Otsuka Y，et al.Plasma microRNA 499 as a biomarker of acute myocardial infarction[J].Clinical Chemistry，2010，56(7)：1183-1185.

[4] De Rosa S，F(xiàn)ichtlscherer S，Lehmann R，et al.Transcoronary concentration gradients of circulating microRNAs[J].Circulation，2011，124(18)：1936-1944.

[5] Xu J，Zhao J，Evan G，et al.Circulating microRNAs：novel biomarkers for cardiovascuLar diseases[J].J Mol Med (Berl)，2012，90(8)：865-875.

[6] D’Alessandra Y，Devanna P，Limana F，et al.Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction[J].Eur Heart J，2010，31(22)：2765-2773.

[7] Falk E，Nakano M，Bentzon JF，et al.Update on acute coronary syndromes：the pathologists’view[J].Eur Heart J，2013，34(10)：719-728.

[8] Cheng Y，Wang X，Yang J，et al.A translational study of urine miRNAs in acute myocardial infarction[J].J Mol Cell Cardiol，2012，53(5)：668-676.

[9] Devaux Y，Vausort M，Goretti E，et al.Use of circulating microRNAs to diagnose acute myocardial infarction[J].Clin Chem，2012，58(3)：559-567.

[10] Peltier HJ，Latham GJ.Normalization of microRNA expression levels in quantitative RT-PCR assays：identification of suitable reference RNA targets in normal and cancerous human solid tissues[J].RNA，2008，14(5)：844-852.

[11] Chang KH，Mestdagh P，Vandesompele J，et al.MicroRNA expression profiling to identify and validate reference genes for relative quantification in colorectal cancer[J].BMC Cancer，2010，10(1)：173.

[12] Bargaje R，Hariharan M，Scaria V，et al.Consensus miRNA expression profiles derived from interplatform normalization of microarray data[J].RNA，2010，16(1)：16-25.

[13] D’Haene B，Mestdagh P，Hellemans J，et al.MiRNA expression profiling：from reference genes to global mean normalization[J].Methods Mol Biol，2012，822：261-272.

[14] Mestdagh P，Van Vlierberghe P，De Weer A，et al.A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization[J].Genome Biol，2009，10(6)：R64.

(本文編輯薛妮)

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(No.20140313015-14)

1.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院在讀碩士研究生(太原 030001)；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院

賈永平，E-mail：275447695@qq.com

信息：魏瑋，賈永平.急性冠脈綜合征病人microRNA-499水平變化的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(12)：1477-1480.

R541.4 R256.2

B

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.12.016

1672-1349(2017)12-1477-04

2016-06-29)