柱前衍生高效液相色譜法檢測肉制品中亞硝胺化合物

洪凰++朱洪亮++葛芳芳

摘要 建立了高效液相色譜法測定了肉制品中N-亞硝基二甲胺（NDMA）、N-亞硝基二乙胺（NDEA）和N-亞硝基吡咯烷（NPIR）化合物的新方法。通過與脫亞硝基化試劑（HBr+HAc）作用，脫去亞硝基生成相應的二級胺，再與丹磺酰氯反應，熒光檢測器（FLD）檢測，保留時間定性，外標法定量。結果表明：該方法在0.1～50.0 μg/mL濃度范圍內，3種化合物均具有良好的線性響應，方法對NDMA、NDEA、NPIR的檢出限均為0.5、2.0、2.0 μg/kg，在不同添加水平下的平均回收率分別在86.7%～116.4%、81.0%～91.5%、82.5%～107.5%之間，相對標準偏差（RSD）均<8.9%。

關鍵詞 柱前衍生；高效液相色譜法；亞硝胺

中圖分類號 O675 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）16-0243-01

亞硝胺是對含有N-N=O化合物的一類物質的統稱，其具有較強的致癌性。亞硝胺類化合物的數量很大，而且多數亞硝胺化合物的致癌性都很強。現有研究表明，已經檢測到的亞硝胺類化合物種類有300多種，有270種以上能夠誘導至少1種動物癌癥。食品中發現的亞硝胺主要為N-二甲基亞硝胺、N-二乙基亞硝胺、亞硝胺吡咯烷等。

目前，針對《食品中N-亞硝胺的檢測標準（GB/T5009.26-2003）》中規定的標準檢測方法為氣相色譜-熱能分析儀法和氣相色譜-高分辨率質譜法。但氣相色譜-熱能分析儀法需要專用的熱能檢測器，高分辨率質譜儀價格昂貴，一般檢測實驗室較少配備。液相色譜法檢測食品中亞硝胺雖有報道[1-2]，但由于在紫外光的照射下會發生分解，造成檢測結果的偏差。但液相色譜具有價格低廉、操作簡便的優點，國內各級實驗室都配備。在實際檢測過程中，尋找一種應用高效液相色譜法測定食品中亞硝胺污染物的方法十分必要。本文通過丹磺酰氯衍生反應改變N-亞硝胺的結構，提高液相色譜對 N-亞硝胺的選擇性和靈敏度，建立了一套基于柱前衍生高效液相色譜測定肉制品中種亞硝胺的新方法，方法簡單，適用性強，解決了各級食品檢測實驗室由于檢測設備的限制而無法對這一類食品中的重要污染物進行監測的難題。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀，配熒光檢測器。

標準儲備溶液的配制：準確稱取適量N-二甲基亞硝胺（NDMA）、N-二乙基亞硝胺（NDEA）、亞硝胺吡咯烷（NPIR）標準品0.100 0 g于100 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋定容至刻度，4 ℃冰箱中保存備用。

丹磺酰氯衍生試劑的配制：稱取丹磺酰氯試劑1.00 g，用乙腈溶解并定容至100 mL容量瓶中。

脫亞硝基化試劑的配制：準確移取48% HBrO3 1.0 mL到10 mL容量瓶中，加冰醋酸稀釋到刻度。

二氯甲烷、乙腈、正己烷均為色譜純；其他試劑均為分析純，試驗用水為超純水。

SPE柱的預處理：在6 mL SPE柱中裝填Ambersorb 572填料1 500 mg，填料上下各墊一層玻璃棉，依次用正己烷10 mL、二氯甲烷10 mL淋洗，抽干殘留溶劑后再用純水10 mL潤洗，備用。

1.2 儀器工作條件

色譜柱：ODS-2 Hypersil C18柱（200×4.6 mm，5μm）；柱溫30 ℃；進樣體積50 μL；流速1.0 mL/min；流動相為乙腈-水（55∶45）；檢測波長：激發波長350 nm，發生波長530 nm。

1.3 試驗方法

稱取粉碎的樣品200.0 g于500 mL水蒸氣蒸餾裝置的蒸餾燒瓶中，加入水100 mL及氯化鈉120 g，充分振搖使氯化鈉完全溶解，連接蒸餾裝置，收集餾出液400 mL。餾出液過SPE柱，保持流速為6 mL/min[3]。

572柱萃取完成后，35 kPa負壓下抽干去除殘余水分， 用二氯甲烷7 mL將亞硝胺化合物洗脫下來。將洗脫液再過無水硫酸鈉柱脫水后，用氮吹儀于40 ℃下濃縮至約100 μL。將上述濃縮液轉移到1.5 mL反應瓶中， 加入脫亞硝基化試劑20 μL，密封后置于100 ℃控溫箱中進行脫亞硝基化反應10 min。冷卻至室溫后，加入2 mol/L氫氧化鈉溶液100 μL，使之呈堿性，然后加入飽和碳酸氫鈉溶液300 μL進行緩沖，再加入丹酰氯溶液100 μL，蓋塞混勻后，于40 ℃恒溫水浴振蕩器內避光反應45 min。反應完畢后，用乙腈定容至5 mL，振蕩混勻后，取適量溶液，用0.45 μm有機濾膜過濾后待測。同時做空白試驗。

2 結果與分析

2.1 脫亞硝基化反應

要將N-亞硝胺化合物結構中的N-NO鍵斷開，需要脫亞硝基試劑（氫溴酸和冰醋酸的混合物），反應發生后，會產生相應的二級胺和NO自由基。根據文獻[3]報道，在100 ℃下反應10 min可得到滿意的結果，因此試驗選取100 ℃和10 min作為脫亞硝基化反應的溫度和時間。

2.2 衍生反應條件的優化

不同的衍生化反應物和反應條件對衍生化反應具有重要的影響。將N-二乙基亞硝胺的脫亞硝基化產物、二乙胺（DMA）應用在試驗中，確定另一種反應物為丹磺酰氯，在不同的反應條件下進行試驗，從而確定衍生化反應的條件。

2.2.1 反應溫度的選擇。為了明確反應溫度對試驗效果的影響，進行了不同溫度下的衍生化反應試驗。試驗設置的溫度為20、30、40、60、80 ℃，反應物為二乙胺與丹磺酰氯，結果發現適當提高溫度有利于提高衍生化反應的進行，反應在 40 ℃時衍生物含量最大，繼續升高溫度對衍生物的生成量影響不大，甚至反而下降，這可能是由于溫度過高導致其他副反應的產生，故選擇40 ℃作為最佳反應溫度。

2.2.2 反應時間的選擇。根據文獻報道[4]，丹磺酰氯與生物多胺的反應在放置過夜或在較短時間內適當加熱均能反應完全，本文固定其他條件，測定在40 ℃時，二乙胺與丹磺酰氯在20～60 min內反應產物的影響，發現在40 min后衍生化產物的生成量基本穩定，故本試驗選定45 min作為反應時間。

2.2.3 pH值對衍生反應的影響。研究表明[5]，弱堿性的反應環境能夠使丹磺酰氯衍生反應獲得較好的效果，而溶液的酸堿性會隨著N-亞硝胺脫亞硝基化反應的進行而逐漸改變，在試驗結束后，溶液呈強酸性，要選擇強堿對其進行中和。本試驗過程中選擇的強堿試劑為NaOH溶液，試劑的濃度為2 mol/L，由此來改變溶液的pH值，再加入300 μL飽和NaHCO3組成緩沖溶液，以考察溶液pH值對反應的影響，結果表明加入100 μL的2 mol/L NaOH溶液時的產率最高[6-10]。

2.3 色譜條件的優化

試驗考察了乙腈-水和甲醇-水2種流動相對目標化合物的分離效果。結果表明，乙腈比甲醇的洗脫能力強，有更好的分離能力，使用甲醇作流動相時，目標化合物不僅保留時間長而且峰型較寬，試驗選擇乙腈和水作為流動相，當乙腈：水的比例為55∶45時，3種化合物峰型良好，且相互之間能夠很好的分離。優化后的標樣分離圖譜見圖1。

2.4 線性關系和檢出限

將試驗儀器按照試驗設計進行設置，測定和繪制標準溶液。繪制標準曲線的過程中以濃度X（μg/L）、峰面積（Y）分別作為橫縱坐標。結果表明，在0.5～50.0 μg/L濃度范圍內，3種亞硝胺化合物線性關系良好，線性相關系數均達到0.995以上，檢出限均在0.2 μg/kg（表1）。

2.5 方法回收率與精密度

在某腌豬肉樣品中分別加入3種亞硝胺化合物混合標準溶液，使其中亞硝胺的含量分別為2.0、20.0 μg/kg，連續測定6次，計算回收率和相對標準偏差（RSD），結果見表2。可以看出，回收率和相對標準偏差均能滿足分析得要求。

3 結論

本文建立了通過柱前衍生以高效液相色譜熒光檢測的方法分析食品中N-亞硝二甲胺、N-亞硝二乙胺、N-亞硝吡咯烷污染物的新方法，該方法的線性范圍及回收率均能滿足分析的要求，可用于肉制品中亞硝胺污染物的檢測分析。

4 參考文獻

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