豬偽狂犬病三種抗體檢測方法的比較

摘 要 為探索滿足豬偽狂犬病防治需要、準確、實用的診斷方法，選用乳膠凝集試驗、膠體金免疫層析技術、酶聯免疫吸附試驗三種診斷方法，以求篩選出一種簡單、快捷、靈敏、特異的臨床檢測方法。結果表明：乳膠凝集試驗具有敏感、簡便、快捷等優點，但其特異性差和假陽性率較高；膠體金免疫試驗的成本低廉，對設備的要求不高，但敏感性、特異性等均較差；酶聯免疫吸附試驗從準確性、靈敏性、特異性等方面都得到比較好的效果。

關鍵詞 豬偽狂犬病；乳膠凝集試驗；膠體金免疫試驗；酶聯免疫吸附試驗；抗體檢測

中圖分類號：S858.28 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2017.09.054

偽狂犬病（Pseudorabies）是一種由皰疹病毒科α皰疹病毒亞科豬皰疹病毒Ⅰ型引起的家畜和多種野生動物的傳染病，豬是本病毒的儲藏者和傳染源。本病對豬造成的危害最嚴重，其特征為體溫升高、劇烈發癢和急性腦脊髓炎癥狀，并引發妊娠母豬流產，死胎以及胎兒出生后短期死亡，該病在豬群中具傳播快、死亡率高、流行范圍廣、傳播途徑多和病原體頑固等特點，每年都給養豬業造成巨大的損失[1]。為了有效預防和控制此病，減少經濟損失，保證和促進我國養豬業的健康發展，需一種簡便、快捷、敏感性高和特異性強且便于使用的方法。

目前，在豬偽狂犬病診斷方面用得最多的是血清學方法，包括血清中和試驗（SN）、乳膠凝集試驗（LA）、瓊脂免疫擴散試驗（AGID）等[2]。通過從某些出現偽狂犬病的典型癥狀的種豬場采血，分離血清，運用臨床上常用的乳膠凝集試驗、膠體金免疫試驗、酶聯免疫吸附試驗，現比較和分析3種方法的準確性、敏感性。

1 材料及方法

1.1 材料

從廣東某三個大型豬場隨機抽樣采血，分離血清，編號（1～15），冷凍保存。

診斷試劑：豬偽狂犬病乳膠凝集試驗診斷試劑盒、豬偽狂犬病抗體免疫金標測試紙、豬偽狂犬病酶聯免疫吸附試驗診斷試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 豬偽狂犬病乳膠凝集試驗

將疑似豬偽狂犬病的血清、標準陽性血清、標準陰性血清分別作1∶2稀釋，各取一滴（10～20 μL）依次加于乳膠凝集板上。各加乳膠抗原一滴，用牙簽混勻，攪拌并搖動1～2 min，于3～5 min內觀察結果。以出現“++”以上者判為陽性凝集。

1.2.2 豬偽狂犬病膠體金免疫試驗

在檢測卡的加樣孔內加入2滴50 μL待檢血清，將檢測卡平放在桌面上，在室溫下靜置15 min后判定結果。判斷標準：陽性，即在觀察孔內，檢測線區（T）及對照線區（C）同時出現紫紅色線，豬偽狂犬病抗體越高，檢測線（T）的顏色越深；弱陽性，即在觀察孔內，檢測線區（T）及對照線區（C）同時出現紫色線，但檢測線區（T）出現的色線顏色很淺；陰性，即在觀察孔內，只有對照線區（C）出現一條紫色紅線；失效，在觀察孔內，檢測線區（T）和對照線區（C）都不出現色線。

1.2.3 豬偽狂犬病酶聯免疫吸附試驗

第一，取出酶標板并記錄樣品在板上的位置。第二，在A1、A2、A3、A4、A5、A6孔內各加未稀釋的陰性對照100μL。第三，加100μL已稀釋的樣品（1∶20）到相應的孔內，每一樣品做2個重復。第四，室溫作用30 min，洗滌3～5次，再在每一孔內加入100 μL的酶標抗體。第五，室溫作用30 min，在每一孔內加入TMB底物溶液100μL。第六，室溫顯色15 min后，加入100 μL終止液以終止反應。第七，在650 nm測量并記錄樣品和對照的吸收值。第八，結果判定：陽性對照的平均值（PCx）與陰性對照（NCx）的平均值之差（P-N）大于或等于0.15時試驗成立，而且陰性對照平均值（NCx）必須大于或等于0.151。每一樣品內針對PRV抗體的有無是由樣品與陽性對照的比率（S/P）來確定，比值小于0.4的樣品確認為PRV抗體陰性，比值大于或等于0.4的樣品確認為PRV抗體陽性。

2 結果

LA、IGFA、ELISA檢測結果見表1。試驗表明，對15份樣品應用LA、IGFA、ELISA方法，同時進行豬偽狂犬病血清抗體檢測，結果為：LA檢測，11份血清判定為陽性，陽性血清率為73.3%；IGFA試驗，10份血清判定為陽性，陽性血清率為66.7%；ELISA試驗，12份血清判為陽性，陽性血清率為80.0%。

3 討論

豬偽狂犬病是阻礙養豬業發展的主要疫病之一，豬感染PRV或免疫之后，產生抗體水平并不高，因此，生產上需要敏感、準確的血清學方法檢測[3]。

從以上結果看出，在3種豬偽狂犬病血清學診斷方法中，乳膠凝集試驗的敏感性高，但特異性差，檢測結果中假陽性較高，但其操作簡便，對人員、設備條件要求不高，檢測成本低，適合作為流行病學調查、疫病監測以及種豬群檢疫凈化陽性豬初篩的檢驗方法使用。

膠體金免疫試驗的準確性、敏感性、特異性均不理想，但具有操作簡便、設備要求低、檢驗成本低廉、結果易于判定等優點，進一步完善后，可作為一種適合基層單位大批量快速檢疫需要的理想檢驗方法，具有很好的開發前景[4]。

間接ELISA試驗因敏感性高、特異性強等優點而被列為國際貿易指定檢測項目之一[5]。目前的試驗室及科研機構常用此方法在臨床上進行定性和定量檢測。

三種試驗的符合率都達到了基本的要求，得到了比較好的效果。間接ELISA試驗在敏感性、特異性、準確性等方面都明顯優于其他兩種試驗，因而可以作為其他試驗結果的參考標準。

目前應用的豬偽狂犬病疫苗均可能干擾現有的血清學檢測方法，因此，作為疫病監測和流行病學調查，為確信結果準確，檢測前應該先確定檢測豬群未使用豬偽狂犬病疫苗免疫；作為科研生物制品廠家，應加強基因缺失疫苗新產品的研制開發和生產，并生產與之配套的診斷試劑；作為種豬場，應在疫苗檢測的基礎上，確定是否上苗，使用何種疫苗，對監測陽性率不高的種豬場要堅決采取疫病凈化的防治措施，確定使用疫苗應選擇基因缺失疫苗，為此后的監測和凈化留有余地。

參考文獻

[1]孫剛，杜宇沛，高忠溶，等.應用瓊脂免疫擴散試驗檢測豬偽狂犬病抗體的研究[J].黑龍江畜牧獸醫，2000（4）：8-9.

[2]邱德新，陳煥春，何啟蓋，等.間接ELISA檢測豬偽狂犬病血清抗體[J].中國獸醫學報，2002（2）：37.

[3]范緯興，胡敬東，吳加強，等.豬偽狂犬病病毒A株的分離鑒定[J].中國獸醫學報，2003（6）：15.

[4]張志，柳淑芳，趙宏坤，等.豬偽狂犬病的診斷方法研究進展[J].養豬，2000（4）：37-38.

[5]國際獸疫局.診斷試劑和疫苗標準手冊[M].青島：青島新聞出版局，1996.

（責任編輯：趙中正）

收稿日期：2017-02-18

作者簡介：范燦洪（1981—），男，廣東佛山人，本科，獸醫師，從事獸醫工作。