高效液相色譜法測定庫爾勒香梨幼果中的4種內源激素

張占暢，孫志紅，鄭小能，劉懷鋒，

(1.石河子大學農學院園藝系，新疆石河子832000;2.兵團第二師農業科學研究所，新疆庫爾勒841503; 3.特色果蔬栽培生理與種質資源利用兵團重點實驗室，新疆石河子832000)

高效液相色譜法測定庫爾勒香梨幼果中的4種內源激素

張占暢1，孫志紅2，鄭小能3，劉懷鋒1，3

(1.石河子大學農學院園藝系，新疆石河子832000;2.兵團第二師農業科學研究所，新疆庫爾勒841503; 3.特色果蔬栽培生理與種質資源利用兵團重點實驗室，新疆石河子832000)

【目的】建立高效液相色譜法(HPLC)，用于同時分離和測定庫爾勒香梨幼果中的玉米素(ZT)、赤霉素(GA3)、生長素(IAA)和脫落酸(ABA)4種植物內源激素?！痉椒ā拷涍^條件篩選和優化，選用80%甲醇作為樣品提取試劑。經過石油醚脫色，PVPP吸附雜質和乙酸乙酯萃取，再經Sep－Pak C18小柱純化。采用SGE ProteCol－P C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，柱溫40℃，流速為1 mL/ min，進樣量10 μL。流動相A為甲醇，流動相B為水(pH=3.5)，流動相比例為:45%(A)與55% (B)。檢測器波長為254 nm。【結果】建立了玉米素、赤霉素、生長素、脫落酸的高效液相色譜分析方法。運用該方法測得加標回收率達80.4%～91.2%，相對偏差在1.54%～8.1%，分離效果理想，實驗效果穩定可靠?！窘Y論】該方法前處理方法簡便，分析速度快，具有較高的重現性和精確性。適用于香梨幼果中內源激素玉米素、赤霉素、生長素和脫落酸的測定分析。

庫爾勒香梨;高效液相色譜法;幼果;內源激素

0 引言

【研究意義】植物激素是植物正常代謝的產物，是在植物體內合成的，并能從產生部位轉移到作用部位，在低濃度下就能調節植物生長發育的有機物質［1］。植物內源激素包括赤霉素、生長素、脫落酸、細胞分裂素、乙烯及油菜素內脂等六大類，對植物的生長、發育、成熟及衰老等生理過程有著顯著的支配作用，并使植物各器官間互通信息，互相協調，從而使整株植物的生長發育進程一致［2，3］。因此，分析香梨花期幼果內源激素含量的變化，對于研究香梨脫萼及提高品質等具有重要的生產實踐價值［4］。【前人研究進展】目前，植物內源激素含量的測定方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、酶聯免疫法(ELISA)及放射免疫法(RIA)，由于后兩種對于激素的提純精度較低以及可重復性較差等問題［5－7］。而高效液相色譜法具有靈敏度高，分辨率高等優點，而且具備同時檢測多種植物激素的特點，因此采用高效液相色譜法作為檢測方法［8，9］。由于內源激素在幼果中含量較低，種類較多，分離時易被破壞，而且檢測條件各異［10，11］。因此篩選合適的提取方法和優化HPLC的檢測方法是試驗的關鍵［12］?！颈狙芯壳腥朦c】目前，關于香梨幼果的激素提取，檢測方法較少，而使用HPLC法檢測庫爾勒香梨內源激素含量更是鮮有報道。研究從提取方法，色譜條件等方面進行優化，而對香梨幼果中ZT、GA3、IAA、ABA 4種內源激素含量同時進行分離與測定?！緮M解決的關鍵問題】建立一種分析香梨幼果內源激素的可靠方法，而為研究庫爾勒香梨生長與調節庫爾勒香梨品質等提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料

液相色譜為島津LC－2010AHT型高效液相色譜儀(日本島津)，包括四元梯度泵、紫外檢測器、HPLC 2D工作站。流動相用KQ－100VDE型超聲波清洗儀脫氣。研磨后的樣品用HITACHI CR22GⅢ冷凍離心機離心。離心后取上清液，用RE－2000A旋轉蒸發器濃縮。

玉米素、赤霉素、生長素、脫落酸標準品購自Sigma公司，甲醇、乙酸為色譜級，乙酸乙酯，鹽酸、磷酸氫二鈉、交聯聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)為分析純，實驗用水為超純水。所有試劑使用前均通過0.45 μm微孔濾膜過濾。

試驗所選材料為新疆庫爾勒地區第二師29團園三連的香梨，于2016年4月26日采取香梨幼果，用錫箔紙包好，置于液氮中速凍帶回實驗室，放入－76℃低溫冰箱保存待測。

1.2 方法

1.2.1 樣品測定

樣品前處理按照參考文獻方法并加以改進和優化［13，14］。準確稱取2 g冷藏的香梨幼果，加入10 mL預冷的80%甲醇研磨成勻漿，置于4℃冰箱靜置后離心取上清液，重復三次合并全部上清液，將全部上清液旋蒸至原體積的三分之一，加入石油醚脫色，再加入0.1 g PVPP震蕩后過濾。將濾液用乙酸乙酯萃取并在35℃下減壓蒸干，殘留物加2 mL乙酸溶解后過Sep－Pak C18小柱純化，用甲醇洗脫后減壓蒸干，用80%甲醇溶解并定容至2 mL，溶液過0.45 μm微孔濾膜過濾后進行HPLC分析。

1.2.2 標準品的配置

分別稱取0.01 g ZT、0.02 g IAA、0.3 g GA3和0.02 g ABA標準品，用純甲醇溶解并定容至100 mL棕色容量瓶，即為4種激素混合標準溶液。以混合標準溶液為母液，逐級稀釋，配制成含有ZT、GA3、IAA和ABA的系列標準溶液，采用優化的色譜條件，依次進樣檢測，以激素質量濃度(mg/mL)為橫坐標，以峰面積( mAU)為縱坐標，建立4種激素的回歸方程。

1.2.3 色譜條件

SGE ProteCol－P C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱;柱溫為40℃;進樣量10 μL;;流速1.0 mL/min;流動相為甲醇:乙酸的水溶液(pH=3.5)=4.5∶5.5(V/V)。測定波長為254 nm;以外標法進行定量分析。

1.2.4 穩定性試驗

用1.2.3所述的色譜條件，對同一濃度的4種激素混合標準溶液通過液相保留峰面積以及記錄保留時間，分別在一日內測定不同時間的日內重現性，取不同5個時間點，每次對標準溶液重復測定3次。日間重現性分析進行3 d的連續測定，每次對標準溶液重復測定3次。

1.2.5 回收率試驗

準確稱取已知4種激素含量的香梨幼果樣品2 g共3份，加入ZT、GA3、IAA和ABA標準品，按1.3方法制備樣品溶液進行測定，計算回收率。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理條件的優化

植物內源激素在不同提取液的提取效率不一樣，香梨幼果中激素含量較低，且又與酮類，酚類共存，在進行HPLC分析時，其他物質不可避免地對分析進行干擾。因此，在前處理階段激素提取的關鍵就是減少雜質的量。在選擇提取試劑時，分別以純甲醇，80%甲醇、純水、乙酸溶液(pH=3.5)作為提取溶劑。檢測結果表明，甲醇作為提取溶劑，不僅在后續脫色，萃取等步驟中較其他溶劑效果明顯，同時，甲醇作為提取試劑，提取效率高，雜峰較少。提取時間分別設置12、14、16、18和20 h。研究表明，激素提取效率隨著浸提時間的增加而增加，但是提取時間超過16 h后提升效果并不明顯，因此，浸提時間設置為16 h。但是，經石油醚脫色和乙酸乙酯萃取后，依然有大量雜質的干擾，選擇采用PVPP、Sep－PakC18小柱對樣品進行進一步的純化處理，4種激素提取效果良好。

2.2 色譜條件的篩選

2.2.1 檢測波長的選擇

取4種激素標準溶液，采用紫外可見光光度計在190～400 nm進行光譜掃描，檢測4種植物激素的最佳吸收波長以確定檢測波長。研究表明，4種激素的最大吸收波長分別為ABA為237 nm，IAA為235 nm，GA3為215和253 nm，ZT為257 nm;綜合分析，由于4種激素在254 nm波長條件下均有良好吸收，因此設置紫外檢測器檢測波長為254 nm。

2.2.2 流動相的比例的選擇

以甲醇和乙酸的水溶液(pH=3.5)作為流動相，選擇不同流動相比例對混合激素標準溶液進行分離。分別設置甲醇比例由20%逐漸提升到80%。研究表明，甲醇含量越高，4種激素洗脫越快。當甲醇含量在20%時，4種激素在28～29 min全部洗脫出來，但出峰時間過晚，檢測時間長，且赤霉素峰形出現平頭峰，表明分離效果較差(圖1 A);而當甲醇含量達到80%時，4種激素在4～5 min洗脫出來，4種激素保留時間過短，導致樣品峰重疊，其中GA3與IAA峰完全重疊，并未分離出來，且其他3種激素分離度極低(圖1 B);當甲醇含量在45%時，4種激素在13～15 min全部分離出來，激素分離度高，峰形尖銳，峰形的對稱性好，分析時間也被縮短，符合試驗要求(圖1 C)。經過對比激素分離度，峰形對稱性及分離時間后，表明流動相條件為甲醇:乙酸的水溶液(pH=3.5)=4.5∶5.5(V/V)時，為最優流動相條件。圖1

圖1 不同流動相比例中的內源激素的色譜圖:1－玉米素、2－赤霉素、3－生長素、4－脫落酸Fig.1 Chromatogram of endogenous hormones in different mobile pHase:1－zeatin(ZT)、2－gibberellic acid(GA3)、3－indole－3－acetic acid(IAA)、4－abscisic acid(ABA)

2.2.3 柱溫、進樣量和流速的選擇

柱溫的選擇對激素分析效果無明顯影響，但顯著影響分析時間，當柱溫為30℃時，4種激素完全分離30～31 min，當柱溫為40℃時，4種激素完全分離需要18～19 min。因此，為提高實驗進程，選擇柱溫為40℃。流速也對分析時間有直接的影響，當流速從0.5上升到2 mL/ min時，激素分析時間逐漸縮短，但是過大流速會增大泵壓，導致激素分離度下降、4種激素峰距過近等問題。經過篩選，最終確定流速為1.0 mL/min。當分別設置進樣量為10、15、20 μL時，隨著進樣量增大，前沿峰出現的頻率越高，且樣品過載對色譜柱危害較大。因此確定進樣量為10 μL。

2.34 種激素的標準曲線

2.3.1 內源激素的定性分析

采用優化后的色譜條件，對混合激素標準液溶液進行HPLC分析，研究表明，ZT、GA3、IAA和ABA的保留時間分別為(4.525±0.408) min、(5.433±0.50)min、(9.761±0.929)和(15.063±1.346)min。圖2

2.3.2 內源激素的定量分析

在優化后的色譜條件下，4種激素檢測靈敏度較高，且分離度，峰形較好。按1.4方法得出各激素的回歸方程。4種激素回歸方程的線性相關系數在0.994 6～0.999 7，表明標準品質量濃度與峰面積相關性良好。同時，按照信噪比(S/N)為3∶1時，得到各激素的檢出限，表明測定結果有較好的精確度和靈敏度。圖1

圖2 在254 nm檢測條件下的混合激素標準品的色譜圖:1－玉米素、2－赤霉素、3－生長素、4－脫落酸Fig.2 Chromatogram of the mixture of hormones standards under 254 nm:1－zeatin(ZT)、2－gibberellic acid(GA3)、3－indole－3－acetic acid(IAA)、4－abscisic acid(ABA)

表1 激素在色譜條件下的的標準曲線和檢出限Table1 Calibration curves of the standards and LOD of hormones under choosed HPLC conditions

2.4 穩定性試驗

按1.2.4試驗方法進行穩定性試驗，研究表明，4種激素日內重現性相對偏差在0.5%～6.92%;4種激素日間重現性相對標準偏差在0.87%～2.53%。通過穩定性試驗，表明使用該方法結果較穩定，儀器精密度及試驗重現性良好。表2

2.5 實際樣品分析

取冷凍的試驗材料2 g，按照1.2方法制備樣品并按上述色譜條件進行分析測定。香梨幼果中4種激素均得到較好的分離結果表明香梨幼果中含玉米素(ZT)16.71 μg/g、赤霉素(GA3)1.28 mg/g、生長素(IAA)32.01 μg/g、脫落酸(ABA)1.67 μg/g。圖3

2.6 回收率的測定

通過香梨幼果樣品測定結果及加標回收率試驗結果表明，ZT、GA3、IAA、ABA的平均回收率分別為80.4%、83.2%、91.2%和90.4%，相對偏差均小于8.1%。樣品前處理方法可以滿足香梨幼果4種內源激素的測定分析。表3

表24 種植物激素的穩定性試驗Table2 Stability test of four kinds of plant hormones

圖3 在254 nm檢測條件下的香梨幼果的色譜圖:1－玉米素、2－赤霉素、3－生長素、4－脫落酸Fig.3 Chromatogram of the pear young fruit under 254 nm:1－zeatin(ZT)、2－gibberellic acid(GA3)、3－indole－3－acetic acid(IAA)、4－abscisic acid(ABA)

表3 各激素的加標回收率(n=3)Table3 Result of standard addtion recovery test of hormones(n=3)

3 討論

試驗用190～400 nm紫外光對4種激素進行了掃描，結果表明，4種激素均在254 nm左右有較好的吸收，選擇254 nm作為檢測波長。在選擇提取溶劑方面，在實驗中發現以純水及乙酸溶液作為提取溶劑時，在石油醚脫色時，脫色效果差，極易出現棗泥狀絮狀物。在后續的檢測中出現提取效果較差，提取的激素含量不穩定等不利因素。因此，最終選擇甲醇作為提取試劑。該選擇與張玉瓊、劉妮等［8，14］研究結果一致。

在選擇純化方式方面，為避免未經純化的提取液堵塞色譜柱，根據前人經驗，采用PVPP吸附法［6］，以盡可能的去除雜質，達到提純激素的目的［15］。PVPP是乙烯基吡咯烷酮的交聯聚合物，具備吸附多酚類和色素類的良好性能［6，16］。Sep技術廣泛用于樣品的分離和純化，可以有效的去除干擾有機化合物。其他研究者發現C18小柱純化植物內源激素效果較好，提高了激素回收率［11，17］。在試驗中，通過在前處理過程中提取液中加入0.1 g PVPP震蕩后過濾，并在提取液壓縮后過C18預處理柱純化，有效的減少了提取液里面的雜質，初步達到了提純激素的目的，提高了分析效果。

在內源激素的定性分析方面，4種激素峰形尖銳，分離度較高，同時在連續3 d的穩定性試驗檢測中，分離效果較穩定，效果良好。在內源激素定量分析方面，各激素相關系數均接近1，所得回歸方程理想。

利用高效液相色譜法對香梨幼果中4種內源激素同時測定，結果符合定量分析要求，誤差小，取得了較好的效果。而赤霉素由于其檢出限較高，在此次分析中出峰難度較大。因此，試驗中赤霉素測定的精確度和回收率與其它激素相比仍有一定差距。關于如何利用高效液相色譜法進一步精確測定赤霉素的試驗條件仍需進一步的研究。

利用試驗確定的高效液相色譜方法，對20個多個不同香梨幼果樣品進行了4種內源激素含量的測定，取得了較好的效果，同時也說明了該方法的可行性。

4 結論

通過優化香梨中4種內源激素的提取條件以及色譜條件，建立了一種以SGE ProteCol－P C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)作色譜柱，甲醇和乙酸的水溶液(pH=3.5)作流動相，設定流動相流速為1.0 mL/min，柱溫為40℃，樣品進樣量為10 μL，采用高效液相色譜法在波長254 nm下同時測定了庫爾勒香梨幼果樣品中的玉米素、生長素、細胞分裂素和脫落酸，分析時間不超過17 min，且4種激素出峰穩定，峰型優質，加標回收率均在80%以上。該方法具有樣品前處理簡單、分離效果較好、精確度高、回收率理想、分析速度快等優點。該方法達到了激素的定量測定要求，適用于香梨以及其他果品多種內源激素含量的同時分析測定。

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Determination of Four Endogenous Hormones in the Young Fruit of Korla Fragrant Pear by High Performance Liquid Chromatography(HPLC)

ZHANG Zhan－chang1，SUN Zhi－hong2，ZHENG Xiao－neng3，LIU Huai－feng LI1，3
(1.Horticultural Department，College of Agronomy，Shihezi University，Shihezi Xinjiang 832000，China; 2.Research Institute of AgriculturalSciences，Division Two，Xinjiang Production and Construction Corps，Korla Xinjiang 841503，China;3.Key Laboratory of Featured Fruits and Vegetables Cultivation Physiology and Germplasm Resources Utilization of Xinjiang Production and Construction Corps，Shihezi Xinjiang 832000，China)

【Objective】A high performance liquid chromatography(HPLC)method was developed to determine the concentration of four endogenous hormones［indole－3－acetic acid(IAA)，abscisic acid (ABA)，gibberellic acid(GA3)，zeatin(ZT)］in young fruit of Korla fragrant pear.【Method】After screening and optimization of conditions，80%methanol was chosen as extraction solvent.Polyvinylpolypyrrolidone(PVPP)was used to absorb impurities.The samples were extracted with petroleum ether and ethyl acetate.The extracts were purified with a reverse pHase Sep－Pak C18 column(250 mm×4.6 mm，5 μm particle size).The column temperature was 40℃.The flow rate was 1 mL/min.The injection volume was 10 μL.The mobile phase was 45%methanol(A)and 55%acetic acid(B，pH=3.5).The detection wavelength was 254 nm.【Result】ZT，GA3，IAA，abscisic acid analysis method of high performance liquid chromatography was established.The HPLC recovery of known concentrations of IAA，ABA，GA3，and ZT ranged between 80.4%and 91.2%.The relative standard deviations(RSDs)ranged between 1.54%and 8.1%.The experimental results were stable and reliable.【Conclusion】The HPLC method developed in this study is simple，rapid，reproducible，and accurate.Therefore，it is suitable for rapid and accurate quantification of ZT，GA3，IAA and ABA in pear fruit.

fragrant pear;HPLC;young fruit;endogenous hormone

LIU Huai－feng(1972－)，Male，Henan Province，Professor，Doctor of agriculture，The research direction is the pHysiology of fruit tree cultivation，(E－mail)lhf_agr@shzu.edu.cn

S601.2

A

1001－4330(2017)05－0886－07

10.6048/j.issn.1001－4330.2017.05.012

2017－03－03

兵團科技計劃南疆專項“庫爾勒香梨優質高效生產關鍵技術研究與示范”(2013BA038)

張占暢(1993－)，男，安徽人，碩士研究生，研究方向為果樹栽培生理，(E－mail)1170258813@qq.com

劉懷鋒(1972－)，男，河南人，教授，博士，研究方向為果樹栽培生理，(E－mail)lhf_agr@shzu.edu.cn

Supported by:Xinjiang Production and Construction Corps Science and Technology Plan(special research program in southern Xinjiang)"Key technology research and demonstration of quality and efficient production of Korlar fragrant pear"(2013BA038)