黑曲霉發酵制備高可溶性膳食纖維豆渣工藝優化及其水合性質研究

謝 歡 涂宗財，2 張 露,2 王 輝 阮傳英

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室1，南昌 330047)(江西師范大學生命科學學院2，南昌 330022)

黑曲霉發酵制備高可溶性膳食纖維豆渣工藝優化及其水合性質研究

謝 歡1涂宗財1，2張 露1,2王 輝1阮傳英1

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室1，南昌 330047)(江西師范大學生命科學學院2，南昌 330022)

以豆渣為原料，以可溶性膳食纖維與總膳食纖維的比例(SDF/TDF)為指標，通過正交試驗優化黑曲霉發酵豆渣制備高SDF豆渣的工藝，并研究黑曲霉發酵時間對豆渣膳食纖維(DF)水合性質的影響。結果顯示黑曲霉發酵豆渣DF的最優條件為：發酵溫度30 ℃，接種量1.5%、料液比1∶3(V/V)、發酵初始pH為自然pH值。在此條件下，發酵后的豆渣中SDF的含量占TDF的37.84%，與未發酵豆渣相比，發酵豆渣的SDF/TDF提高了7.19倍，發酵過程中產生的半纖維素酶將半纖維素水解轉化為SDF是SDF/TDF升高的主要原因。在最佳發酵條件下發酵36 h時，豆渣DF的持水力增加了55.33%，膨脹力增加了60.67%，結合水力增加了21.74%，因此黑曲霉發酵可作為提高豆渣膳食纖維品質的有效方法。

豆渣 可溶性膳食纖維 黑曲霉 發酵 水合性質

膳食纖維是人類“第七大營養素”，分為可溶和不可溶性膳食纖維(SDF和IDF)，它在預防和治療肥胖、糖尿病和腸道疾病等方面具有特殊功效，如清除自由基、調節血糖、降低膽固醇，延緩小腸對葡萄糖的吸收，增強腸道蠕動，防止結腸癌、便秘等，其中SDF比IDF具有更強的功能性[1-3]。因此，富含可溶性膳食纖維的食品成為一種理想的降血壓、降血脂、降血糖以及降膽固醇的健康和保健食品。

我國是大豆的主要生產和消費大國，豆渣是豆制品生產加工中產生的主要副產物，每年產生大量的豆渣。由于豆渣水分含量高、易腐爛、不耐儲存，顆粒大、口感粗糙等特點[4-5]，大部分豆渣被當作動物飼料或者直接作為廢棄物丟棄，利用率非常低。但干燥后的豆渣中膳食纖維含量高達60%，同時富含蛋白質(以干計約20%)和鈣、鉀等礦物質，是一種極好的天然膳食纖維來源[6]，可作為一種新型的保健食品原料。因此如何將豆渣轉化為高品質膳食纖維產品成為目前國內外研究的熱點。

目前報道的提高膳食纖維中SDF含量的方法有化學法、生物法、物理法[4-5]和物理-生物結合法[7]。發酵法因其成本低、操作簡單、產率高、易實現工業化生產的特點成為目前膳食纖維改性的有效方法之一，它在提高膳食纖維中SDF和IDF的比例同時，可改善膳食纖維的理化性質，如持水力、膨脹力等[8-9]。黑曲霉是國際公認的可用于食品生產的安全菌株，它在發酵過程中能產生纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶等豐富的酶系，可更好的作用于底物，將大分子纖維素降解成較小分子物質，提高SDF的含量(黑曲霉及其應用研究進展[10-11]，同時其產生的短鏈脂肪酸類物質可以改善膳食纖維的持水力等物化特性[12]。

因此本試驗以黑曲霉為菌種，采用正交試驗優化黑曲霉發酵豆渣制備可溶性膳食纖維的工藝條件，并對發酵后的豆渣膳食纖維的水合性質進行研究，旨在提高豆渣膳食纖維中SDF的含量及其品質，從而真正將工業廢棄物利用起來，變廢為寶，同時為科學合理的改善豆渣中膳食纖維的營養價值及其功能性質提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆渣、馬鈴薯：市售木瓜蛋白酶Sigma公司；熱穩定α-淀粉酶、糖化酶 北京奧博星生物技術有限責任公司；乙醇、丙酮、葡萄糖、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉均為分析純試劑。

ZDX-35BI型座式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；PYX-150H-B恒溫恒濕培養箱 廈門精藝興業科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 豆渣發酵

新鮮豆渣→60 ℃烘干12 h → 粉碎 → 過80目篩→ 調料→ 裝罐→ 滅菌→ 冷卻→ 接種→發酵培養→60 ℃烘干→粉碎→理化分析。

1.2.2 單因素試驗

取料液比、酶接種量、初始pH和發酵溫度4個因素進行單因素試驗。準確稱取30 g豆渣，按一定的料液比與蒸餾水混勻后接種黑曲霉，在一定 pH和溫度條件下發酵，相對濕度控制在85%左右，發酵完后測定樣品中SDF/TDF的比值。每個試驗做3次平行，取平均值。

1.2.3 正交試驗

根據單因素試驗的結果，選擇對豆渣中SDF/TDF影響較大的三個發酵條件進行L9(33)正交試驗，確定黑曲霉發酵提高豆渣SDF/TDF比值的最佳工藝，正交因素及水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表

1.2.4 豆渣中膳食纖維的測定

采用AOAC991.43酶-重量法[13]，總膳食纖維(TDF)、不溶性膳食纖維(IDF)和可溶性膳食纖維(SDF)的測定計算公式如下：

式中：R1和R2為雙份樣品殘留物質量/mg，P和A分別為蛋白質和灰分質量/mg，M1和M2為樣品質量/mg。

1.2.5 膨脹力的測定[14]

準確稱取0.5 g(m)膳食纖維于盛有蒸餾水并帶有刻度的玻璃試管中振蕩均勻，靜置后記錄膳食纖維初始體積V1(mL)，25 ℃下放置24 h后測量膳食纖維樣品在試管中的膨脹體積V2(mL)，膳食纖維的膨脹力計算公式如下：

1.2.6 持水性的測定[14]

準確稱取3 g(m1)樣品于50 mL離心管中，加入25 mL蒸餾水后在25 ℃下攪拌30 min，2500 g離心10 min，棄去上清液并用濾紙吸干離心管壁殘留水分，然后將膳食纖維轉移到表面皿上稱重m2(g)，樣品的持水力(g/g)為：

1.2.7 結合水力的測定[15]

先將100 mg(m)膳食纖維浸泡于25℃的蒸餾水中，在14 000 g下離心處理l h，小心除去上層清液，殘留物置于G-2多孔玻璃增塌上靜置1 h，稱重該殘留物m1，然后在120 ℃下干燥2 h后再次稱重殘留物m2，膳食纖維樣品結合水的能力(g/g)為：

1.2.8 酶活測定[16-17]

果膠酶酶活定義：每分鐘單位質量的粗酶粉水解果膠生成1 μg的果糖為一個酶活單位。

半纖維素酶活定義：每分鐘單位質量的粗酶粉水解木聚糖生成1 μg的木糖為一個酶活單位。

纖維素酶活定義：每分鐘單位質量的粗酶粉水解纖維素生成1 μg的葡萄糖為一個酶活單位。

取1 g最佳條件下發酵后的豆渣用水稀釋定容至100 mL，取0.5 mL溶液，加入1.5 mL多糖(纖維素、半纖維素、果膠)酶解30 min，然后用DNS測定單糖含量。酶活(μg·min-1·mg-1)計算公式為：

式中：m為所測木糖、果糖或葡萄糖的質量/μg；1 000為豆渣樣品的質量/mg；30為酶解時間/min；0.5為測試樣品體積/mL；100為樣品總體積/mL。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果與討論

2.1.1 不同料液比對SDF/TDF的影響

取30 g豆渣，分別以1∶1、1∶2、1∶3、1∶4和1∶5的料液比與蒸餾水混勻，然后按1%接種量加入黑曲霉，在自然pH(pH 5～6)條件下28 ℃發酵3 d，相對濕度控制在85%左右。發酵完后測定樣品中SDF和TDF的含量。

不同料液比對SDF/TDF的影響如圖1(A)所示。隨料液比的增加，SDF/TDF出現先增大后減小的趨勢，當料液比為1∶4時，發酵得到較多的SDF，SDF/TDF達30.25%，是料液比為1∶1時(11.32%)的2.67倍。這說明當固態發酵的水分含量不足時，黑曲霉生長受到限制，發酵不能充分進行，影響SDF的得率，而含水量過大時，豆渣基質的濕度過大，發酵體系的通氣、散熱性差，豆渣易結塊成團，不利于黑曲霉的生長，從而抑制纖維素酶、半纖維素酶等酶系的產生[18]，因此選1∶3、1∶3.5、1∶4進行后續正交試驗。

圖1 不同料液比(A)、接種量(B)、發酵溫度(C)、發酵初始pH(D)對SDF/TDF的影響曲線

2.1.2 不同的接種量對SDF/TDF的影響

取30 g豆渣以1∶4的料液比與蒸餾水混勻，分別按0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%的接種量加入黑曲霉，在自然pH條件下28 ℃發酵3 d，相對濕度控制在85%左右，發酵完后測定樣品中SDF和TDF的含量。

不同的接種量對SDF/TDF如圖1(B)所示。由圖可知，隨著接種量的增加，SDF/TDF出現先增大后減小的趨勢，當接種量為1%時，豆渣樣品中的SDF/TDF出現最高值，為33.43%。這說明當接種量太少時，菌的生長過于緩慢，存在著較長時間的環境適應期，相應的代謝時間縮短，即在本試驗中表現為產酶量的不足，進而影響SDF的得率。但如果接種量過大，將導致菌體過速生長，出現菌內競爭，使得菌不能得到充足的營養而使生長代謝受到限制[14]。因此接種量選0.5%、1%、1.5%作為后續正交試驗。

2.1.3 發酵溫度對SDF/TDF的影響

取30 g豆渣以1:4的料液比與蒸餾水混勻，并按1.0%的接種量加入黑曲霉，然后在自然pH條件下，分別于20、25、30、35、40 ℃發酵3 d，相對濕度控制在85%左右，發酵完后測定樣品中SDF和TDF的含量。

不同發酵溫度對SDF/TDF如圖1(C)所示。由圖可知，隨著發酵溫度的增加，SDF/TDF出現先增大后減小的趨勢，當發酵溫度為30 ℃時發酵得到最多的SDF，SDF/TDF達32.97%。當發酵溫度大于30 ℃時，發酵溫度越高，SDF/TDF反而下降，這可能與黑曲霉的生長和代謝受溫度影響，以及纖維素酶、半纖維素酶等酶類的最佳酶活溫度有關。馮培勇等[19]證明，黑曲霉發酵產纖維素酶活力最大的最佳發酵溫度為31℃。因此我們選25、30、35 ℃做后續正交試驗。

2.1.4 發酵初始pH值

取30 g豆渣以1:4的料液比與蒸餾水混勻，按1.0%的接種量加入黑曲霉，然后分別在pH 3、4、5、6、7、8條件下30 ℃發酵3 d，相對濕度控制在85%左右，發酵完后測定樣品中SDF和TDF的含量。

由圖1(D)可知，隨著起始pH 值的升高, SDF/TDF的值呈先上升后下降的趨勢，當起始pH 值為5.0時，豆渣膳食纖維有最大的SDF/TDF值36.22%，即發酵得到最多的SDF。但當pH高于5之后，SDF/TDF值開始下降，當高于pH 6時，SDF/TDF急劇降低。由于豆渣與水的混合溶液的天然pH為5～6，pH為5和6時發酵豆渣樣品的SDF/TDF相差不大。考慮到發酵的經濟性和安全性，以及操作過程的簡便性，選擇用自然pH進行發酵。因此確定黑曲霉發酵豆渣的適宜初始pH為天然pH，即pH為5～6。

2.2 正交試驗結果分析

由表2中正交試驗結果的極差分析可知，A、B、C三個因素的主次順序為：A>C>B即對黑曲霉發酵豆渣中SDF/TDF值影響最大的是發酵溫度，其次是料液比，影響最小的是接種量。最佳發酵條件為A2B3C1：發酵溫度30 ℃、接種量1.5%、料液比1∶3(g/mL)、發酵初始pH為自然pH值。在此條件下，豆渣中SDF/TDF達37.84%，較未發酵豆渣中的5.26%提高了7.19倍，較優化前的36.22%提高了1.62個百分點。

表2 正交試驗數據與結果

2.3 SDF/TDF值、水合性質及酶活隨發酵時間的變化

根據正交試驗得到的最佳條件進行發酵，即豆渣30 g、料液比1∶3、接種量1.5%、初始pH為自然pH，相對濕度85%左右，研究黑曲霉在固態發酵豆渣的過程中，纖維素酶、果膠酶、半纖維酶的酶活、以及發酵豆渣的SDF/TDF值和水合性質隨著發酵時間(0～96 h)的變化。

2.3.1 酶活的變化

纖維素酶、果膠酶、半纖維酶酶活隨發酵時間的變化如圖2所示。纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱；廣義的半纖維素酶是指能夠降解半纖維素、木聚糖生成木寡糖和木糖的一組酶的總稱；果膠酶可將果膠分解成半乳糖醛酸等物質的酶[20]。豆渣膳食纖維由纖維素、半纖維素、果膠、木質素(含量極低)組成，以上三類酶的綜合作用，使TDF 的糖苷鍵斷裂，生成小分子多糖，提高SDF/TDF值，改善豆渣膳食纖維的性質和生理功能。姜竹茂等[21]在豆渣中添加3%(V/V)纖維素酶液，50 ℃酶解1.5 h，可使可溶性膳食纖維提高到16.59%。半纖維素酶在發酵60 h后達到最大酶活10 758.48 μg·min-1·mg-1，而果膠酶的酶活一直處于上升趨勢，纖維素酶活在發酵36 h后達到最大值4 975.3μg·min-1·mg-1，隨后呈先下降后上升的趨勢。這可能是由于隨著發酵時間的延長(0～36 h)，黑曲霉生長，菌體數目增加，自身生產纖維素酶、果膠酶和半纖維酶的量增加，使測得的單位質量的豆渣中這3種酶的活力上升。但隨著發酵時間的進一步延長(>36 h)，反應體系的溫度上升，pH下降，營養物質逐漸被消耗，有毒物質開始積累，導致半纖維素酶和果膠酶酶活的上升速率下降，而使纖維素酶的酶活力降低，在發酵60 h時酶活達最低值。因此，在發酵的不同階段，黑曲霉自身生產纖維素酶、果膠酶、半纖維酶的量和這些酶在培養基中發揮主要作用的順序不同。

圖2 發酵過程中酶活的變化

2.3.2 SDF/TDF值隨發酵時間的變化

由圖3可知，隨著發酵的進行，SDF/TDF先上升至最大值后又逐漸下降，當發酵時間為48 h時，SDF/TDF最高36.92%。這可能是由黑曲霉在發酵豆渣過程中產生的半纖維素酶對半纖維素的降解作用所導致的，相關性分析顯示半纖維素酶酶活與SDF/TDF相關性為0.902，果膠酶酶活與SDF/TDF相關性較小(0.328)，而纖維素酶與SDF/TDF幾乎無相關性。即發酵過程中不溶性半纖維素在半纖維素酶作用下酶解為SDF，這可能是SDF/TDF升高的主要原因，這與Zongcai Tu等[7]從單糖組成分析得出IDF轉化為SDF主要是半纖維變化的結論相一致。而隨著發酵的進行，基質物質逐漸被消耗，黑曲霉開始分解利用SDF，將其進一步降解為單糖、二糖等可直接作為生長代謝碳源的小分子糖，因此發酵后期SDF減少[22]。

圖3 SDF/TDF隨發酵時間的變化

2.3.3 水合性質

在最佳發酵條件下發酵豆渣，豆渣DF的水合性質(持水力、結合水力、膨脹力)隨發酵時間的變化如圖4。TDF的持水力先增大后降低，發酵36 h時達到的最大值2.33 g/g，較未發酵豆渣的持水力1.50 g/g增加了55.33%。豆渣DF的結合水力隨發酵時間的變化增加的較少，但最大水合能力(36h時)較未發酵樣品增加了21.74%。豆渣DF的膨脹力隨發酵時間的延長先增大后下降，后又有所回升，發酵36 h后豆渣膨脹力達到最大值為4.29 mL/g，這比未發酵豆渣的膨脹力(2.67 mL/g)增加了60.67%。纖維素酶水合力的增加可能是由于黑曲霉發酵產生的纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和對豆渣基料中的纖維素、淀粉、蛋白質的水解作用[14]，這一方面使細胞壁破裂，豆渣顆粒變小，增加了纖維素與水結合的表面積(黑曲霉和米曲霉發酵改善豆渣口感)；另一方面增加了纖維顆粒孔洞的數量和體積，使纖維結構變得較疏松、溶脹的，從而水更易進入分子的內部，增加豆渣的水合性質[23]。當發酵時間超過36 h后，豆渣膳食纖維的持水力和膨脹力隨發酵時間的延長逐漸降低，這可能是由于半纖維素酶酶活的增加(圖2)使半纖維素、木聚糖進一步降解為小分子的木寡糖和木糖，使豆渣樣品中TDF的相對含量降低，豆渣的持水力和膨脹力下降[22]。吸水膨脹力是膳食纖維預防便秘、腸癌等生理功能的重要物理指標，因此從某種意義上來說，豆渣也可以作為一種防便秘的食物。黑曲霉發酵可使豆渣DF的水合性質得到改善。

圖4 膳食纖維水合性質隨發酵時間的變化

3 結論

本研究通過單因素和正交試驗，以SDF/TDF比值為評價指標，得到了黑曲霉發酵對豆渣DF改性的最佳發酵條件：發酵溫度為30 ℃、接種量為1.5%、豆渣：水為1:3、發酵初始pH為自然pH值。在此發酵條件下SDF/TDF的值可以達到37.84%，較未發酵時提高了7.19倍。

黑曲霉發酵可大大提高豆渣DF的水合性質，在最佳參數條件下發酵36 h時，豆渣DF的持水力增加了55.33%，膨脹力增加了60.67%，結合水力增加了21.74%。纖維素酶和半纖維素酶分別在發酵36 h和60 h時達到最大酶活，發酵過程中產生的半纖維素酶將半纖維素水解轉化是SDF/TDF升高的主要原因。

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Process Optimization of Preparation of Soluble Dietary Fiber Bean Dregs byAspergillusnigerand Hydration Properties

Xie Huan1Tu Zongcai1,2Zhang Lu1,2Wang Hui1Ruan Chuanying1
(National Key Laboratory of Science Science and Technology, Nanchang University1, Nanchang 330047)(Jiangxi Normal University2, Nanchang 330022)

In this research, theAspergillusnigerfermentation parameters for preparing soybean dregs with high content of soluble dietary fibers (SDF) were optimized by using orthogonal experiment with the ratio of SDF and total

dietary fibers (TDF) as indicator and bean dregs as raw materials. Effect of fermentation time on the hydration properties of soybean dregs DF was also estimated. The results indicated that the optimal fermentation parameters were as follows: fermentation temperature 30 ℃, inoculation quantity 1.5%, solid/liquid ratio 1∶3 (g/mL), initial fermentation pH of natural pH value. Under such conditions, the SDF/TDF value in fermented soybean dregs reached to 37.84%, which was improved by 7.19 times compared with that without fermentation. This could be resulted from the hydrolyzation of hemicellulose into SDF induced by hemicellulase produced during fermentation. The water-holding, swelling and water-binding capacity of soybean dregs fermented for 36 h under the optimal parameters were increased by 55.33%, 60.67% and 21.74%, respectively. Thus, fermentation withAspergillusnigercan be an effective method to improve the quality of soybean dregs.

soybean dregs, soluble dietary fiber,aspergillusniger, fermentation, hydration properties

863計劃(2011AA 100803)，江西省現代農業產業技術體系建設專項(JXARS-04)

2015-08-23

謝歡，男，1991年出生，碩士，食物資源的高效利用與開發

涂宗財，男，1965年出生，教授，博士生導師，食物資源的高效利用與開發

TS209

A

1003-0174(2017)04-0116-07