一株伏馬毒素降解菌的篩選與鑒定

楊朋飛 常曉嬌 伍松陵 王 峻 王楠希 屈凌波 孫長坡

(河南工業大學生物工程學院1，鄭州 450001) (國家糧食局科學研究院2，北京 100037)(河南工業大學糧油食品學院3，鄭州 450001)

一株伏馬毒素降解菌的篩選與鑒定

楊朋飛1,2常曉嬌2,3伍松陵2王 峻2王楠希2屈凌波1孫長坡2

(河南工業大學生物工程學院1，鄭州 450001) (國家糧食局科學研究院2，北京 100037)(河南工業大學糧油食品學院3，鄭州 450001)

以伏馬毒素FB1為唯一碳源，采用富集培養法從污泥樣品中分離到1株高效降解FB1的菌株。經高效液相色譜(HPLC)法檢測，該菌在液體無機鹽培養基(MSM)中對FB1有良好的削減能力，5 d內可將25 μg的FB1完全降解。通過對該菌的16S rDNA序列進行同源性分析，并結合生理生化試驗，最終鑒定為鞘氨醇盒菌(Sphingopyxissp.)，命名為ASAG22。ASAG22細胞內產生的活性物質將FB1降解為4種質荷比分別為406.352 7、288.209 9、264.182 7和220.156 9的新物質，且該活性物質經蛋白酶K處理而失去活性。

伏馬毒素 鞘氨醇盒菌 生物降解

伏馬毒素(Fumonisins，FB)主要是串珠鐮刀菌(Fusariummoniliforme)，多育鐮刀菌(F.proliferatum)，輪枝鐮孢菌(F.verticillioides)和花腐鐮孢菌(F.anthophilum)等鐮刀菌產生的水溶性次級代謝物[1]。1988年，由Gelderblom從串珠鐮刀菌培養液中分離出，至今共發現FB1(相對分子量721.83，化學結構式如圖1)、FB2和FB3等28種伏馬毒素[2]。其中，FB1的占比最高(約70%)，污染范圍最廣，毒性也最強。

圖1 FB1的化學結構式

伏馬毒素主要存在于玉米、小麥、豆類等谷物和其加工制品中[2]。美洲、歐洲、非洲和亞洲溫帶地區的污染玉米中都發現了FB存在[3]。2011年，Biomin公司對來自世界各地的4 327份飼料及飼料原料進行檢測，發現FB的陽性檢出率為51%[4]。FB在國際上沒有統一的限量標準，美國FDA規定的食品中最大限量為2.0 μg/g[5]，歐盟為1.0 μg/g[6]，而我國至今未出臺FB的限量標準。聯合國糧農組織和世界衛生組織食品添加劑聯合專家委員會暫定人類對FB每日最大耐受攝入量為2 μg/(kg·d)[7]。

伏馬毒素的毒性對人畜危害非常大。FB會對馬、豬、牛、羊、雞和鴨等牲畜的心臟、腎臟和肝臟產生致命毒性[8]。流行病學調查顯示人類食管癌與食用FB污染的谷物有關[9]。中國山東省某地區原發性肝癌發病率的提高也與FB污染有關[10]。國際癌癥研究中心評估伏馬毒素對人類的危害后，將其列為可能致癌物[11]。

去除糧油食品中的FB，保證食品安全是當前研究的熱點。Generotti等[12]研究了在工業加工過程FB在谷物制品中的含量變化，結果顯示清洗和谷物去皮可減少谷物粉中約40%的FB。Xing等[13]用ELISA法檢測八種植物的精油對FB1的降解作用，發現肉桂油對FB1的降解率達94.08%。Heinl等[14]在細菌Sphingopyxissp. MTA144中找到了水解FB1的關鍵基因，并且推測經過兩步酶促反應將FB1脫毒。FB的結構非常穩定[15]，物理和化學方法不能有效去除FB，而且還會殘留其它物質；生物法可將FB轉化、代謝為低毒或無毒產物，是一種非常有前景的方法。2014年11月，百奧明研發的FB降解酶制劑FUMzyme成為首個得到歐盟認證的能將FB通過生物轉化降解為無毒代謝產物的酶制劑。有學者已經篩選到了FB降解菌，Camilo等[16]從玉米和青貯飼料中篩選到1株酵母菌(SE3071)和3株芽孢桿菌(S9、S10和S69)，它們對FB1的降解率分別為57%、43%、48%和83%。Raffaella等[15]從意大利的玉米地采集了21份土壤樣品中分離到1株革蘭氏陰性菌NCB1492(疑似新種)，將該菌在BYE液體培養基(FB1含量為0.5 mg/mL)中振蕩培養，經5次轉接共培養了42 d，用薄層色譜法檢測發現FB1完全降解。本研究采用富集培養法，以FB1為唯一碳源，從污泥中分離到1株可以完全降解FB1的菌株，為食品和飼料中的FB降解研究提供良好的基礎材料。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

1.1.1 樣品

樣品采集于北京、河南和云南三地的土壤、污泥和發霉的玉米，詳細來源見表1。

表1 樣品來源

1.1.2 試劑與培養基

色譜級甲醇、乙腈：美國Thermo Fisher公司；FB1標準品：北京泰樂祺科技有限公司；PMD 19-T Vector、DNA Marker、Premix Taq酶：Takara公司；培養基及其它生化試劑：北京鼎國昌盛生物技術公司。

無機鹽培養基(MSM)：MgSO4·7H2O 0.2 g，(NH4)2SO40.5 g，CaCl2·2H2O 0.066 g，Na2HPO4·12H2O 6.15 g，KH2PO41.52 g，加去離子水定容至1 L，調pH至6.8；LB培養基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，加去離子水定容至1 L；PBS緩沖液：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO41.44 g，KH2PO40.24 g，加去離子水定容至1 L，用鹽酸調pH至7.4，培養基及緩沖液均于121 ℃滅菌20 min，固體培養基加1.3%的瓊脂粉；鄰苯二甲醛(OPA)衍生液：40 mg OPA溶于1 mL甲醇中，用5 mL 0.1 mol/L四硼酸鈉溶液稀釋，加50 μL β-巰基乙醇，混勻，避光保存；FB1毒素管：25 μg的FB1中加500 μL MSM液體培養基。

1.2 儀器設備

Waters e2695高效液相色譜儀、熒光檢測器(2475)、Waters xbridge C18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)：美國Waters公司；Agilent 6510 Q-TOF LC/MS：美國Agilent公司；BIO-C1000型PCR儀、電泳槽、凝膠成像儀：美國Bio-Rad公司；二級生物安全柜：美國Esco公司；恒溫搖床：瑞士Infors公司；紫外可見分光光度計：美國Thermo公司；Centrifuge 5810R型高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 FB1降解菌株的篩選與分離

取5 g樣品于30 mL無菌水中混勻，靜置取上清液100 μL進行梯度稀釋，分別取濃度為10-6、10-7和10-8的菌懸液200 μL于FB1毒素管中，在漩渦振蕩器上混勻，再涂布于固體MSM平板上，置于30 ℃培養箱中培養7 d。對長出的菌斑劃線分離，于30 ℃培養3 ～ 5 d。挑取單菌落于FB1毒素管中，30 ℃，220 r/min培養10 d。從毒素管中取100 μL待測液于液相小瓶中，再加入400 μL 50%乙腈水和500 μL OPA衍生液，混勻，靜置1 min，HPLC檢測。

1.3.2 FB1的HPLC檢測方法

FB1的高效液相色譜檢測前處理及檢測條件參考GB/T 25228—2010[17]。

1.3.3 ASAG22的鑒定

形態鑒定：將純化的菌株在固體LB平板劃線，30 ℃培養至長出單菌落，觀察菌落顏色、大小、形狀、邊緣、表面、隆起形狀和透明度等指標。對菌株進行革蘭氏染色，于顯微鏡下觀察細菌形態并拍照。

理化鑒定：在中國科學院微生物所用Biolog微生物鑒定系統對ASAG22進行了68種碳源的利用試驗和23種化學物質的敏感試驗。

分子生物學鑒定：以ASAG22的菌液為模板，細菌的通用引物16SF和16SR作為上下游引物。PCR反應體系：模板1 μL， Premix Taq 12.5 μL，16SF、16SR各1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR反應程序：98 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，30個循環，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。對PCR產物進行膠回收，連接體系10 μL：目的片段3 μL，PMD19-T Vector 1 μL，10×T4 DNA 連接緩沖液1 μL，T4 DNA 連接酶(350 U/μL)1 μL，ddH2O 4 μL，16 ℃連接8 h。連接產物熱激轉化至E.coliDH5α感受態細胞中，進行藍白斑篩選。對長出的白菌斑進行PCR鑒定和酶切鑒定，正確后送華大基因公司測序。測序結果在NCBI上使用BLAST進行序列比對。

1.3.4 菌株生長和降解能力的測定

菌株生長曲線繪制：設置3組平行試驗，分別從平板上挑取ASAG22單菌落于100 mL液體LB培養基中，30 ℃，220 r/min培養。每隔4 h取樣1次，并測其在波長600 nm時的吸光度。

菌株降解曲線的繪制：設置3組平行試驗，分別從平板上挑取ASAG22單菌落于FB1毒素管中，30 ℃，220 r/min培養。每隔1 d取樣1次，并用HPLC檢測，計算降解率。

1.3.5 降解FB1活性物質的定位和性質的初步分析

從平板上挑取ASAG22單菌落于5 mL液體LB培養基中，30 ℃，220 r/min培養過夜，按1%接種量轉接于100 mL液體LB培養基中，培養1 d。取培養的菌液于4 ℃，8 000 r/min離心10 min。上清液用0.22 μm水系濾膜過濾，取500 μL上清濾液于FB1毒素管中，以100 ℃滅活的濾液作對照。將收集的菌體用30 mL PBS緩沖液清洗3次，并將菌體懸浮于30 mL PBS緩沖液中。用高壓細胞破碎儀，設置壓強為15 Kpsi，破碎菌體。菌體破碎液于4 ℃，8 000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm水系濾膜過濾，取500 μL上清濾液于FB1毒素管中，以100 ℃滅活的上清濾液作對照。將500 μL PBS緩沖液加入FB1毒素管作為空白對照。試驗組和對照組均于30 ℃，220 r/min培養3 d，用HPLC檢測。

取細胞破碎后的上清液2 mL加50 μL蛋白酶K(20 mg/mL)混勻，55 ℃溫浴1 h。分別取500 μL破碎上清液、蛋白酶K處理液和蛋白酶K處理滅活液加入FB1毒素管。30 ℃，220 r/min培養3 d，用HPLC檢測。

1.3.6 菌株ASAG22對FB1降解產物的初步分析

從平板上挑取ASAG22單菌落于FB1毒素管中，30 ℃，220 r/min培養。間隔1 d取樣，每次取樣100 μL，共取樣5次，5 ppm的FB1標準品作對照。每次取樣完畢，立即放入真空濃縮儀，60 ℃蒸干1 h。蒸干樣品于200 μL甲醇中超聲復溶，16 000 g離心10 min，取上清液稀釋10倍待測。質譜條件參考李正翔等[18]的檢測方法。通過每個樣品特征離子提取及比對，分析ASAG22降解FB1后的產物。

2 結果與分析

2.1 FB1降解菌株的篩選和分離

將采集的 14個樣品進行富集培養，對有降解能力的菌株進行分離，從樣品E中分離出1株FB1高效降解菌，命名為ASAG22。在MSM培養基中，30 ℃，220 r/min，培養5 d，可將25 μg的FB1完全降解，完全降解后的HPLC圖譜，如圖2所示。FB1保留時間RT=8.198 min，對照組樣品此處有強吸收峰，而加入降解菌的試驗組樣品基本無FB1目標峰檢出，表明培養液中FB1已被完全降解。

圖2 FB1完全降解后的HPLC圖譜

2.2 ASAG22的鑒定

2.2.1 形態鑒定

通過平板劃線培養5 d后觀察可發現：菌落呈黃色不透明，圓形，邊緣完整，表面光滑，有隆起，易挑取(圖3左)；革蘭氏陰性菌，無芽孢，短桿狀(圖3右)。

圖3 菌株ASAG22的菌落特征和革蘭氏染色顯微鏡照片

2.2.2 理化鑒定

ASAG22可以利用D-甘露糖、龍膽二糖、L-乳酸和D-半乳糖等32種碳源，不能利用明膠、檸檬酸、D-山梨醇和甘油等36種碳源。對四唑藍、萘啶酸和1%NaCl等10種化學物質敏感，對氯化鋰、溴酸鈉和四唑紫等13種化學物質不敏感。

2.2.3 分子生物學鑒定

將經過酶切和PCR驗證得到的16S rDNA基因片段進行測序，發現其大小為1 494 bp。BLAST比對結果顯示：菌株ASAG22與鞘氨醇盒菌(Sphingopyxissp.)同源性高達99%。送中科院微生物所進行菌種鑒定，根據菌株的細胞形態、生理生化特性、16S rDNA序列等試驗數據綜合分析，鑒定該菌為鞘氨醇盒菌。

2.3 菌株的生長特性和降解特性

降解菌ASAG22的生長曲線與降解曲線如圖4所示。在液體LB培養基中，30 ℃，220 r/min培養12 h進入對數生長期，20 h進入穩定期。在MSM培養基中，降解菌的生長雖緩慢，但對FB1有很好的降解效果。從2 d開始降解速率明顯加快，培養5 d可將培養基中的毒素(25 μg)完全清除。

圖4 降解菌ASAG22的生長曲線與降解曲線

2.4 降解FB1活性物質的定位和性質的初步分析

菌株ASAG22的培養液上清和菌體破碎后的上清對FB1的降解率分別為13%和99%，而兩者的滅活液沒有降解效果(圖5)。這表明，菌株ASAG22的某種胞內活性物質能夠降解FB1。進一步研究表明，加入蛋白酶K的上清液和兩者滅活液對FB1的降解能力明顯降低(圖6)，這說明，菌株ASAG22胞內產生的這種活性物質經過蛋白酶K處理后失去了活性。初步推斷，ASAG22對FB1的降解源于細胞內產生的活性物質，且該物質被蛋白酶K處理后失去對FB1的降解能力。

圖5 不同上清液對FB1的降解率 注：CK1為菌液上清滅活 上清1為菌液上清；CK2為破碎上清滅活 上清2為破碎上清。

圖6 不同處理方法對FB1的降解率 注：處理1為上清加蛋白酶K；處理2為上清；處理3為上清和蛋白酶K都滅活。

2.5 菌株ASAG22對FB1降解產物的初步分析

分析每個樣品的總離子流圖(圖7，從上到下依次為對照組和1～5 d的TIC圖譜)，與FB1標準品的TIC圖譜比對后發現4種豐度較高的新物質：406.352 7、288.209 9、264.182 7和220.156 9(4種新物質對應的質荷比標注在第5天的TIC圖譜中)。其中406.352 7可以初步認定為FB1脫去2分子丙三羧酸后的產物，這一結果與Heinl等[14]的研究結果一致，其他的新物質有待進一步確證。

圖7 ASAG22對FB11～5 d降解產物的TIC圖譜

3 結論

3.1 通過富集培養法，從污泥樣品中篩選到1株鞘氨醇盒菌(Sphingopyxissp.)，命名為ASAG22。在MSM培養基中培養5 d，可將25 μg的FB1完全降解。

3.2 該菌細胞內產生的活性物質可以將FB1降解，且該活性物質經蛋白酶K處理而失去活性。

3.3 分析時間梯度降解試驗的TIC圖譜，發現FB1降解產物中有4種高豐度產物，分別是406.352 7、288.209 9、264.182 7和220.156 9。

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Screening and Identification of A Fumonisins Degradation Bacteria

Yang Pengfei1,2Chang Xiaojiao2,3Wu Songling2Wang Jun2Wang Nanxi2Qu Lingbo1Sun Changpo2
(College of Bioengineering, Henan University of Technology1, Zhengzhou 450001)(Academy of State Administration of Grain2, Beijing 100037)(College of Food Science and Technology, Henan University of Technology3, Zhengzhou 450001)

Using fumonisins FB1as the sole carbon source, a bacterial strain efficiently degrading the FB1degradation strain was screened from sludge samples by an enrichment culture approach. The strain, finally named ASAG22, can degrade FB1well in liquid MSM culture and completely degrade 25 μg FB1in 5 days by high performance liquid chromatography detection. It was identified asSphingopyxissp. on the basis of homology analysis of the 16S rDNA sequence analysis combining with physiological and biochemical test. Further research about the degradation mechanism of strain showed that the active substance generated from ASAG22 cell degraded FB1into four new degradation products, i.e., 406.352 7, 288.209 9, 264.182 7 and 220.156 9.And the active material can inactivate through the treatment of proteinase K.

fumonisins,Sphingopyxissp., biodegradation

國家重點基礎研究發展計劃(2013CB127805)

2015-09-08

楊朋飛，男，1989年出生，碩士，藥物化學

孫長坡，男，1975年出生，博士，研究員，糧油微生物與質量安全

Q939.9

A

1003-0174(2017)04-0110-06