冷榨花生粕蛋白多肽-亞鐵螯合物制備工藝優(yōu)化及結構分析

李玉珍 肖懷秋, 趙謀明 林親錄

(湖南化工職業(yè)技術學院制藥與生物工程學院1,株洲 412004)(華南理工大學輕工與食品學院2,廣州 510640) (中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院3,長沙 410004)

冷榨花生粕蛋白多肽-亞鐵螯合物制備工藝優(yōu)化及結構分析

李玉珍1肖懷秋1,2趙謀明2林親錄3

(湖南化工職業(yè)技術學院制藥與生物工程學院1,株洲 412004)(華南理工大學輕工與食品學院2,廣州 510640) (中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院3,長沙 410004)

以酶法水解冷榨花生粕蛋白質粉制備得到的花生多肽液(<3 000 u)為原料，以氯化亞鐵為金屬螯合劑，在單因素試驗基礎上，利用Box-Behnken響應面優(yōu)化技術對多肽-亞鐵螯合條件進行優(yōu)化分析并獲得最優(yōu)螯合工藝參數(shù)，即多肽-亞鐵質量比為4.31∶1(g/g)，螯合溫度為25.4 ℃，螯合時間28.5 min和螯合pH 7.5，在此優(yōu)化條件下，多肽-亞鐵螯合率為(85.68±1.27)%(n=3)，與模型預測值89.653 1%接近，偏差為4.64%。花生粕蛋白多肽-亞鐵螯合物經紫外光譜和紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e2+與多肽中的NH2+以及COO-形成共價配位鍵并形成穩(wěn)定的共軛結構，是一種新型有機金屬螯合物。

冷榨花生粕 多肽 多肽-亞鐵螯合物 響應面優(yōu)化

食物來源中的鐵元素大部分以高價鐵(Fe3+)形式存在，吸收效率低，當以亞鐵(Fe2+)形式存在時，生物利用率更高且結構更穩(wěn)定，易被人體胃腸道消化、吸收和轉運。鐵元素在蛋白質和酶的合成、物質與能量代謝以及生理免疫等生理過程中發(fā)揮重要作用。缺鐵嚴重時會導致缺鐵性貧血(IDA)、細胞色素和含鐵酶活性降低、供氧不足、電子傳遞和能量代謝過程紊亂、機體免疫功能下降和生長發(fā)育遲緩等生理疾病[1]。20世紀80年代就開始了鐵補充劑的研究，但主要以無機鐵鹽或有機鐵鹽作為鐵補充劑，存在穩(wěn)定性差、胃腸刺激大、易受到腸內容物干擾、生物利用率低、價格高和存在一定毒副作用等不足[2]。蛋白質經酶法水解獲得的多肽片段其一級結構上存在大量鍵合金屬離子的配位基團，與亞鐵螯合后，消化吸收率可得到明顯改善，且金屬螯合肽可利用小肽配位體轉運系統(tǒng)進行轉運(非金屬轉運系統(tǒng)吸收)，具有轉運耗能低、轉運速度快和不易被飽和等優(yōu)點，有利于促進亞鐵元素的吸收利用[1, 3]。同時，當金屬離子和多肽螯合后能抑制小腸刷狀緣細胞上肽酶的水解活性，抑制多肽水解，有助于完整多肽作為金屬元素的載體通過小肽轉運系統(tǒng)進入腸黏膜細胞，提高金屬營養(yǎng)補充劑的穩(wěn)定性[1]。此外，在胃腸道中金屬與多肽配位體結合形成脂溶性的絡合物有機表面，借此形式吸收并通過腸黏膜細胞的類脂屏障轉運入細胞，可減少金屬元素間的拮抗作用[4]。因此，以蛋白多肽為載體螯合金屬離子作為金屬營養(yǎng)補充劑(或強化劑)成為了當前多肽營養(yǎng)研究的重點和熱點，且具有廣闊的市場前景和應用潛力。

當前，亞鐵蛋白多肽載體主要集中在豬血多肽、烏雞肽、酪蛋白磷酸肽、米蛋白肽、魚類蛋白肽等方面，對冷榨花生粕蛋白多肽與亞鐵螯合的研究較少[1]。

本試驗以酶法水解冷榨花生粕蛋白質粉制備得到的花生粕蛋白多肽液(<3 000 u)為原料，以氯化亞鐵為金屬螯合劑，在單因素試驗基礎上，利用Box-Behnken響應面優(yōu)化技術對多肽-亞鐵螯合條件進行優(yōu)化分析，并利用UV和FT-IR對螯合物結構進行分析，研究結果為花生多肽-亞鐵螯合營養(yǎng)補充劑的制備提供理論與技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷榨花生粕蛋白多肽液:自制[5]；堿性蛋白酶:Ruitaibio公司；其它試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

LABCONCO冷凍干燥儀:美國labconco公司；HERMLE Z323K冷凍離心機:德國Hermle公司；R508B旋轉蒸發(fā)儀:國京上海實驗室設備有限公司；可見分光度計:上海舜宇恒平儀器有限公司；UV-2500紫外可見分光光度計:日本島津公司；IRPrestige-21島津傅里葉變換紅外光譜儀:日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 <3 000 u花生粕蛋白多肽液的制備

將制備得到的花生粕蛋白多肽液[5]在0.25 MPa壓力條件下依次透過分子質量為5 000 u和3 000 u的超濾膜，收集分子質量<3 000 u的超濾液經旋轉蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥后備用。

1.3.2 花生粕蛋白多肽-亞鐵螯合工藝

配制一系列不同蛋白多肽-亞鐵質量比的混合液，用0.1 mol/L的NaOH或HCl調節(jié)溶液至合適pH，在一定溫度下混合反應一定時間，反應完成后用無水乙醇沉淀，離心(2 000 r/min，15 min)，收集濾渣，備用。

1.3.3 花生粕蛋白多肽-亞鐵螯合條件的優(yōu)化1.3.3.1 單因素試驗

1)蛋白多肽-亞鐵質量比對螯合率的影響：將花生粕蛋白多肽與氯化亞鐵按預定質量比(0.5∶1～5∶1，g/g)混合，調節(jié)pH至7.0，30 ℃反應30 min，無水乙醇沉淀，離心，收集濾渣，測定并計算螯合率。

2)螯合溫度對螯合率的影響：將花生粕蛋白多肽與氯化亞鐵按質量比4∶1混合，調節(jié)pH至7.0，在20～45 ℃下反應30 min，無水乙醇沉淀、離心、收集濾渣，測定并計算螯合率。

3)螯合pH對螯合率的影響：將花生粕蛋白多肽與氯化亞鐵按質量比4∶1混合，在pH 3.0～11.0條件下25 ℃反應30 min，無水乙醇沉淀、離心、收集濾渣，測定并計算螯合率。

4)螯合時間對螯合率的影響：按花生粕蛋白多肽與亞鐵配比4∶1進行混合，在25 ℃，pH為7.0，反應10～50 min，無水乙醇沉淀、離心、收集濾渣，測定并計算螯合率。

1.3.3.2 響應面優(yōu)化

在單因素試驗基礎上，利用Design-Expert 8.0.6的Box-Behnken響應面優(yōu)化模塊進行多肽-亞鐵螯合條件優(yōu)化。試驗因素及編碼如表1所示。

表1 試驗因素水平和編碼

注：xi=(Xi-X0)/Δx(xi為自變量編碼值，Xi為自變量真實值，X0為中心點處自變量真實值，Δx為自變量變化步長。

1.3.4 花生肽-亞鐵螯合率的計算

鐵含量測定采用鄰菲羅琳比色法[6]。

亞鐵螯合率=m1/m0×100%。

式中：m1為螯合物中鐵的質量/mg；m0為加入反應體系中的鐵質量/mg。

1.3.5 水解度的測定

采取pH-stat[7]法，水解度計算公式為：

式中：B為消耗NaOH的體積/mL；Nb為堿當量；mp為水解使用的冷榨花生粕蛋白粉的質量/g；htot為蛋白質底物中的總肽鍵數(shù)，對于花生蛋白，htot為7.13 meq/g[8]；1/α為pH-stat法的校正因子，即α-氨基解離度的倒數(shù)。pK為α-氨基的平均解離度，可由Gibbs-Helmholz方程計算，在50 ℃時，1/α為1.13。

1.3.6 多肽-亞鐵螯合物結構分析

利用紫外光譜對氯化亞鐵、蛋白多肽及蛋白多肽-亞鐵螯合物進行紫外掃描并進行結構解析。此外，將蛋白多肽液和蛋白多肽-亞鐵螯合物提純后，除去樣品結晶水和游離水，準確稱取2 mg放入瑪瑙研缽中與干燥光譜純KBr 200 mg混合研磨均勻(紅外燈下進行)、壓片并進行紅外光譜掃描和結構解析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

考察了多肽-亞鐵質量比(0.5∶1～5∶1，g/g)、螯合溫度(20～45 ℃)、螯合pH(3.0～11.0)和螯合時間(10～50 min)對螯合率的影響，結果如圖1所示。

圖1 多肽-亞鐵質量比、螯合溫度、螯合pH和螯合時間對螯合率的影響

多肽-亞鐵質量比是影響螯合率的重要因素。質量比太小，無法形成穩(wěn)定環(huán)狀多肽-亞鐵螯合結構且穩(wěn)定性較差，而質量比太大，則反應不完全，易造成多肽浪費。螯合率隨多肽-亞鐵質量比的增大呈先升后降趨勢，當質量比為4∶1時，螯合率達到最大；金屬離子配位反應通常為快速反應，反應溫度對其影響不大[6]。當螯合溫度為25 ℃時螯合率達到最大，溫度進一步提高對螯合率影響不大，螯合溫度以25 ℃較好，試驗結果與蔡冰娜等[6]一致；pH是影響多肽-金屬螯合的重要因素，在酸性和堿性條件下均不利于多肽與金屬的螯合，主要原因是由于在較低pH條件下，H+與金屬離子競爭性爭奪供電子基團，降低了多肽-亞鐵螯合率，而在堿性環(huán)境中，OH-將與供電子基團競爭性的搶奪亞鐵離子，易形成氫氧化物沉淀，降低螯合率。pH 7.0左右螯合率相對較高。研究結果與孫莉潔等[9]研究一致；一般金屬離子螯合反應為快速反應，反應時間的影響較小[6]。螯合時間達到25 min時，螯合率趨于平緩，繼續(xù)延長螯合時間，螯合率無明顯增加，因此，選擇25 min為較優(yōu)的螯合時間。

2.2 蛋白多肽與亞鐵螯合條件的響應面優(yōu)化

對多肽-亞鐵質量比(X1)、螯合溫度(X2)、螯合時間(X3)和螯合pH(X4)進行響應面優(yōu)化分析。試驗設計與結果見表2。為減少試驗誤差，試驗次序隨機安排。

表2 響應面優(yōu)化設計與試驗結果(含模型預測值)

2.2.1 模型序貫分析與數(shù)學模型構建

在方差分析和回歸分析基礎上進行模型序貫分析(model sequential analysis, MSA)[10]以找尋最優(yōu)適配模型，結果如表3所示。

由MSA可知，一階線性模型顯著性分析為極顯著(P<0.01)，失擬項也極顯著(P<0.01)，表明數(shù)據擬合效果較差，需用更高階數(shù)值模型進行數(shù)據擬合；二因素交互關系模型失擬項也極顯著(P< 0.01)，也不宜用來進行數(shù)值模擬；二階模型顯著性分析為極顯著(P<0.01)，失擬項不顯著(P>0.05)。因此，用二階模型對數(shù)據進行擬合是可行的。三階模型顯著性分析不顯著(P>0.05)，失擬項也不顯著(P>0.05)，用三階模型進行數(shù)值模擬并不合適且三階模型回歸方程較為復雜，應用不便。因此，選擇二階非線性回歸方程對表2數(shù)據進行回歸擬合，擬合得到回歸方程為：

y=85.72+11.07x1+2.95x2+5.96x3+5.64x4-2.35x1x2+1.02x1x3-0.85x1x4-7.94x2x3+4.39x2x4+4.01x3x4-17.74x12-7.65x22-10.40x32-9.24x42

表3 響應面模型構建序貫分析

注：**表示極顯著(P<0.01);*表示顯著(P<0.05);ns表示不顯著(P>0.05)，余同。

2.2.2 回歸模型方差分析

方差分析表明(表4)，回歸模型極顯著(P<0.01)，R2=0.994 9，Adj.R2=0.988 9，表明用該模型進行數(shù)值分析是可靠的，能解釋98.89%的總變異。模型Adj.R2數(shù)值越大，表示模型預測值與實測值間擬合度越好，必須要大于0.80[11]。本模型Adj.R2=0.988 9>0.80，表明模型是可靠的。模型失擬項不顯著，表明用此二階模型進行數(shù)值預測不會造成數(shù)值模擬的失真。模型變異系數(shù)(CV)是衡量模型精密度和可靠性的重要評價指標，數(shù)值越小代表模型越可靠，本模型CV為2.15%，表明模型是高度可靠的。通常情況下，可靠模型信躁比(signal to noise ratio, SNR)要求數(shù)值要大于4[11]。本模型SNR=42.313>4，表明模型信躁比是合理的。模型各系數(shù)項顯著性檢驗發(fā)現(xiàn)，一次項X1、X2、X3和X4影響極顯著(P<0.01)，交互作用項X1X2、X2X3、X2X4和X3X4影響極顯著(P<0.01)、X1X3和X1X4影響不顯著(P>0.05)；二次項X12、X22、X32和X42影響均極顯著(P<0.01)。

表4 回歸模型方差分析表

2.2.3 響應面優(yōu)化模型診斷

殘差分析是借助圖形分析工具并基于模型無法完全解釋總變異基礎上進行的[11]。開展誤差方差齊性檢驗對于模型診斷是必需的。若預測值內部t化殘差分布呈隨機散點分布，則殘差方差齊性是符合要求的。由圖2可看出，模型殘差分布呈隨機散點分布。殘差正態(tài)分布也是檢驗模型準確性的重要工具，若模型殘差呈正態(tài)概率分布，則殘差擬合曲線呈線性[11]。由圖3可看出，模型殘差分布呈正態(tài)分布且相互獨立。

圖2 預測值內部t化殘差分布圖

圖3 內部t化殘差正態(tài)分曲線

2.2.4 回歸方程求最優(yōu)解

將回歸方程分別對各自變量求偏導并令結果為零，聯(lián)立可得到方程組，通過規(guī)劃求解可求出方程組編碼水平最優(yōu)解，即x1=0.308、x2=0.075、x3=0.347和x4=0.385，轉換后得到對應因素實際水平，即多肽-亞鐵質量比為4.308∶1，螯合溫度為25.375 ℃，螯合時間28.47 min和螯合pH為7.385。為應用方便，將優(yōu)化條件修約為多肽-亞鐵質量比為4.31∶1，螯合溫度為25.4 ℃，螯合時間28.5 min和螯合pH 7.5。優(yōu)化條件下驗證試驗結果為(85.68±1.27)%(n=3)，與模型預測值89.653 1%接近，偏差為4.64%。

2.3 多肽-亞鐵螯合物的結構分析

為分析花生粕蛋白多肽是否與亞鐵離子有效螯合，對氯化亞鐵、蛋白多肽和蛋白多肽-亞鐵螯合物分別進行紫外掃描。由圖4可以看出，氯化亞鐵在310 nm區(qū)間有吸收峰，未螯合多肽樣品在200～400 nm沒有明顯吸收峰，而多肽-亞鐵螯合物在215 nm處明顯吸收峰。其原因是由于多肽與亞鐵螯合后，使紫外吸收發(fā)生了位移，由此可推斷，多肽與亞鐵進行了有效螯合。

圖4 FeCl2、多肽和多肽-亞鐵螯合物紫外吸收光譜

對多肽和多肽-亞鐵螯合物進行了紅外光譜掃描。從圖5可看出，多肽與亞鐵螯合后，一些主要吸收峰發(fā)生明顯改變。在花生粕蛋白多肽的紅外光譜圖的特征區(qū)，由于N-H的伸縮振動，-NH2在3 404 cm-1處具有吸收峰[12]，當多肽與亞鐵螯合后，3 404 cm-1處的-NH2峰消失，而在1 110 cm-1處出現(xiàn)了PtNH2吸收峰，說明，亞鐵離子與多肽中的氨基進行了有效結合；此外，在1 654.92 cm-1(Υascoo-)和1 226.73 cm-1(rscoo-)處有2個強的羰基吸收峰，其波數(shù)差Δσ為428.19 cm-1，其可能原因是由于花生肽螯合亞鐵后，伸縮振動和變角振動等受到了遏制[13]，表明螯合物中亞鐵離子可能與羰基通過共價配位鍵形成共軛結構環(huán)，由此可以說明，蛋白多肽氨基中的N和羧基中的O參與了與亞鐵的金屬配位螯合反應。螯合物可能結構如圖6所示。

圖5 多肽和多肽-Fe2+螯合物紅外吸收光譜

圖6 多肽-亞鐵螯合物可能結構

3 討論與結論

霍健聰?shù)萚14]研究發(fā)現(xiàn)，多肽與亞鐵離子以環(huán)狀結構進行螯合，配位螯合可改善螯合環(huán)和羰基電子分布，增強其生物學功能。由于花生粕蛋白多肽-亞鐵螯合物無水乙醇等有機溶劑中的溶解度極小[15]，試驗選擇水溶液體系進行多肽-金屬螯合反應，反應完成后用無水乙醇進行沉淀析出，從而分離得到純凈的多肽-亞鐵螯合物。為獲得多肽與亞鐵最佳螯合參數(shù)，利用單因素試驗和響應面優(yōu)化技術對多肽-亞鐵螯合工藝參數(shù)進行了優(yōu)化分析并獲得了優(yōu)化條件，即多肽-亞鐵質量比為4.31∶1、25.4 ℃、pH 7.5和螯合時間28.5 min，在此優(yōu)化條件下驗證試驗結果為(85.68±1.27)%，基本接近模型預測值。紫外光譜和紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)，花生粕蛋白多肽與亞鐵有效螯合，F(xiàn)e2+與花生粕蛋白多肽中的NH2+以及COO-形成共價配位鍵，形成穩(wěn)定的多肽-Fe2+配合物共軛結構。

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Optimization of Preparation Technology for Cold-Pressed Peanut Meal Albumen Polypeptide-Ferrous Chelator and Structure Analysis

Li Yuzhen1Xiao Huaiqiu1,2Zhao Mouming2Lin Qinlu3
(Pharmaceutical and Bioengineering School, Hunan Chemical Industry and Vocational Technology College1, Zhuzhou 412004)(College of Light Industry and Food science, South China University of Technology2, Guangzhou 510640)(College of Food Science and Engineering,Central South University of Forestry and Technology3,Changsha 410004)

Peanut polypeptide liquid (<3 000 u) that prepared by enzymatic hydrolysis of peanut protein power from cold-pressed peanut meal (CPPM) was raw metarial and the ferrous chloride was metal chelator. The optimal chelate technological parameters was obtained after the the optimized analysis to the polypeptide-ferrous chelator by using Box-Behnken response surface optimization technique based on single factor experiment, ie., polypeptide-ferrous mass ratio was 4.31∶1(g/g),chelating temperature was 25.4 ℃,chelating time was 28.5 min and chelating pH was 7.5. Under the optimization condition, the polypeptide-ferrous chelation rate was (85.68±1.27)% (n=3), which was well agreement with the model predicted value (89.653 1%), and the deviation between the confirmative result and the predicted result was 4.64%. Through ultraviolet spectroscopy (UV) and infrared spectrometer(FT-IR) analysis, peanut meal albumen polypeptide-ferrous chelate was found, the Fe2+and NH2+in the polypeptide and COO-form covalence coordinate bond and form stable conjugated structure, which was a new-type organic metal-chelator.

cold-pressed peanut meal (CPPM), polypeptide, polypeptide-ferrous chelator (PFC), response surface optimization.

湖南省高校科研項目(12C1049)，湖南化工職業(yè)技術學院院級項目(HNHY2015002)，2016年湖南教育廳科學研究項目(16C0550)

2015-09-19

李玉珍，女，1981年出生，碩士，植物蛋白質資源精深加工技術

肖懷秋，男，1981年出生，副教授，植物蛋白多肽及多肽金屬營養(yǎng)補充劑

TS202.3

A

1003-0174(2017)04-0064-06