噴射蒸煮結合超濾制備火麻蛋白及其功能特性表征

吳俊鋒 楊曉泉 朱元莊

(華南理工大學輕工與食品學院；淀粉與植物蛋白深加工教育部工程研究中心1，廣州 510640)(晉城市漢寶生物科技有限公司2，晉城 048300)

噴射蒸煮結合超濾制備火麻蛋白及其功能特性表征

吳俊鋒1楊曉泉1朱元莊2

(華南理工大學輕工與食品學院；淀粉與植物蛋白深加工教育部工程研究中心1，廣州 510640)(晉城市漢寶生物科技有限公司2，晉城 048300)

探索了膠體磨等因素對火麻蛋白提取的影響，并確定了最佳工藝，進而利用噴射蒸煮結合超濾技術從變性火麻粕中制備了火麻蛋白，并對其理化及功能性質進行表征。膜法火麻蛋白(membrane hemp protein，MHP)與傳統酸沉法火麻蛋白(traditional acid precipitation hemp protein，THP)蛋白質量分數分別為83.21%與92.24%；其提取率分別為45.37%與40.23%，顯著高于未經研磨及熱處理所得提取率(16.11%)。電泳表明MHP組成更豐富，且具健康功能。與THP相比，MHP的溶解性、持水性及起泡能力均較好，而泡沫穩定性較差。在pH 2.0及pH 10.0時，2種蛋白的乳化穩定性均優于其他條件下所表現的性質，且MHP具有較好乳化活性。可見噴射蒸煮結合超濾能顯著提高火麻蛋白的提取率，且制備的蛋白表現出良好性質。

變性火麻粕 火麻蛋白 噴射蒸煮 超濾技術 理化功能性質

火麻(CannabissativaL.)通過高溫壓榨產生的火麻油具有較好的營養性，從而產生了大量的副產物——脫殼的變性火麻粕(denatured defatted hemp meal, DDHM)；該副產物富含蛋白，而蛋白變性后較難用傳方法來提取其中的蛋白。

噴射蒸煮(jet-cooking)技術是集高溫高壓、高剪切力于一體的水熱處理技術，可以顯著提高蛋白的溶出率。Xia等[1]研究表明，該技術能有效地從熱穩定米糠中制備良好功能性的米糠蛋白，Yang等[2]通過該技術從難溶性大豆濃縮蛋白中制備了可溶性大豆蛋白。膜超濾技術具有分離及濃縮的作用，可以去除一定小分子物質。

本試驗研究了膠體磨等因素對火麻蛋白提取率的影響，確定了最佳的工藝。以最佳工藝下的膜超濾法與傳統酸沉法制備了兩種蛋白，分別稱為膜法火麻蛋白與傳統酸沉法火麻蛋白，對其理化功能性質進行了探討。本研究利用噴射蒸煮結合膜技術從變性火麻粕中制備火麻蛋白，有效提高了蛋白提取率。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

脫殼的變性火麻粕及未脫殼變性火麻粕(denatured defatted hemp meal with skull, DDHMS)與脫殼非變性火麻粕(undenatured defatted hemp meal, UDHM)：晉城市漢寶生物科技有限公司；大豆油：市售；其他試劑均為分析純。

TA Q100差示掃描量熱儀：美國Newcastle公司；Dispax reactor立式膠體磨：德國IKA公司；BQ50S膜設備：保定雷弗流體科技有限公司；HIPS15聚砜膜：德國貝朗公司；噴射蒸煮系統：廣州南聯食品機械有限公司；Waters 2695高效液相色譜儀：美國Waters公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 DSC表征

依Meng等[3]方法測定火麻粕的變性程度。取4.0 mg UDHM和DDHM于鋁盤中，加入10 μL磷酸緩沖液(10 mmol/L, pH 7.0)后密封，以6 ℃/min從20 ℃加熱至120 ℃,空鋁盤作為對照。原料的變性起始溫度(T0)、熱變性溫度(Td)、吸收峰焓變(ΔH)及吸收峰半峰寬度(ΔT1/2)通過Universal Analysis 2000得出。

1.2.2 蛋白制備

按1∶10的料液比在脫殼變性粕中加入去離子水，用2 mol/L NaOH調節pH至9.0。室溫攪拌30 min，然后轉至膠體磨(6 000 r/min, 10 min)進行研磨，之后回調pH至9.0，室溫下再次攪拌20 min。接著轉至噴射蒸煮系統(130 ℃, 90 s)進行熱處理，待冷卻后離心(8 000 r/min, 20 min, 25 ℃)，棄沉淀，收集上清液。

MHP制備：上清液進行循環超濾，泵流速900 mL/min，聚砜膜截留分子質量80 ku。等上清液體積至一半時，加入等量去離子水，此為1次循環，超濾直至透過液無色為止。至上清液濃縮至一定濃度之后，凍干即可。

THP制備：依Tang等[4]方法，有所改動。用2 mol/L HCl將上清液pH調至5.0，離心(8 000 r/min, 20 min,25 ℃)后收集沉淀。沉淀以1∶8的量加入去離子水，用2 mol/L NaOH調pH至7.5，攪拌使其溶解，凍干即可。

用AOAC方法[5]測定變性火麻粕、MHP及THP化學組成。蛋白得率/%=Mp/M0×100，蛋白提取率/%=(Cp× Mp)/(C0× M0) ×100，其中Cp，C0分別為火麻蛋白和火麻粕的蛋白純度/%，Mp，M0分別為火麻蛋白和火麻粕的質量/g。

1.2.3 SDS-PAGE

取適量樣品溶于Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)中，β-巰基乙醇作為還原劑。沸水煮5 min后離心(5 000 r/min, 5 min)，取5 μL上清液與蛋白標品作為上樣液。采用不連續系統進行電泳，上樣液在濃縮膠時電流為20 mA，進入分離膠后為40 mA。電泳結束后，用考馬斯亮藍染色，脫色液為甲醇-乙酸水溶液(甲醇∶乙酸∶水=220∶44∶236，V/V/V)。

1.2.4 溶解度測定

樣品溶于水中，形成1%的蛋白溶液，調至不同pH。于室溫下充分溶解后，8 000 r/min離心20 min,然后采用Lorry法測定上清液的蛋白含量，以牛血清蛋白作標準蛋白制作標準曲線。溶解度=上清液蛋白含量/樣品蛋白含量×100%。

1.2.5 持水性

1.0 g樣品置于25 mL預稱重的離心管(m0)中，加入15 mL不同pH的水中，攪拌20 min。然后8 000 r/min離心20 min，棄上清液，稱量離心管質量為m1。持水性=(m1-m0-1.0)/1.0。

1.2.6 乳化性與起泡性

不同pH 1%的樣品溶液18 mL與6 mL大豆油在10 000 r/min的均質機中攪打1 min，在0與10 min時均從底部取100 μL乳液，然后分別與5 mL 0.1% SDS溶液漩渦5 s，馬上于500 nm測定吸光值A0與A10。

乳化活性=(2×2.303×A0×DF)/c×Φ×(1-θ), 乳化穩定性/min=(A0×10)/(A0-A10)，其中DF為稀釋因子(50)，c是樣品初始質量濃度/g/mL，Φ是光程(1 cm)，θ是乳液中油的比率。

不同pH 的1%樣品溶液20 mL在10 000 r/min的均質機中攪打2 min，馬上轉移至50 mL量筒中，分別記錄0與30 min的體積V1與V2/mL。氣泡能力=(V1-V0)/V0, 氣泡穩定性=(V2-V0)/V0，其中V0為均質前體積。

1.3 數據分析

每次試驗重復3次，結果以平均值±標準偏差(Means±SD)來表示。利用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析和OriginPro 8.0軟件進行作圖，置信度為95%的最小顯著性差異來比較平均值。

2 結果與討論

2.1 原料與產品的基本表征

2.1.1 化學組成與提取率

由表1可知，DDHMS由于未脫殼，因而其蛋白質量分數較低，而纖維含量較高；UDHM的蛋白質量分數較高，纖維含量較低，因為其是經脫殼后進行提油處理而得到的非變性粕。DDHM的蛋白質量分數達63.69%，顯著高于Malomo等[6](44.32%)及Tang等[4](50.20%)的報道，這可能與火麻種類有關。此外火麻粕主要還由纖維(13.52%)和水分(9.24%)組成。MHP的蛋白質量分數(83.21%)顯著低于THP的蛋白質量分數(92.24%)。一是超濾的次數不夠，未能把一些非蛋白組分充分除去；二是膜系統不能把可溶性纖維除去，因為MHP的纖維質量分數(4.52%)確實要高于THP(2.11%)。水分的差異主要是2種蛋白的持水性不同，這和圖5顯示的MHP持水性要高于THP持水性是吻合的。兩者所含的脂肪沒有顯著差異，說明提取方法對其影響不大。表1顯示THP與MHP提取率分別為40.23%、45.37%，顯著高于未處理所得的蛋白提取率(16.11%)和僅進行研磨制備的蛋白提取率(35.10%)。可知僅用簡單的工藝不能有效地從變性粕提取蛋白，而研磨及熱處理可以有效地促進蛋白的溶解，從而提高蛋白提取率。

表1 DDHMS，UDHM，DDHM，MHP和THP的化學組成與提取率

注：表中數據為平均數±標準偏差，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.1.2 DDHM與UDHM的DSC及特征值

2種火麻粕的DSC及特征值如圖1與表2所示。DDHM的熱變性溫度為98 ℃，低于UDHM的熱變性溫度99.3 ℃，說明DDHM的結構已遭到一定的破壞。從焓變值也可以發現，本試驗的火麻粕焓變較小，僅為5.7 J/g，同樣說明在高溫榨油過程中，蛋白的三級或者高級結構受到了破壞。

圖1 UDDHM與DDHM的DSC

表2 UDHM與DDHM的DSC特征值

注：a變性起始溫度，b熱變性溫度，c吸收峰焓變，d吸收峰半峰寬度。表中數據為平均數±標準偏差，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 火麻蛋白提取工藝優化

2.2.1 膠體磨及熱處理影響

火麻蛋白提取工藝的優化采用堿溶酸沉法來進行。由圖2可知，膠體磨及熱處理對火麻蛋白的提取率有很大的影響。變性火麻粕未通過預處理，蛋白的提取率僅有16.11%，而膠體磨處理的則顯著提高提取率，達到35.10%，進一步的熱處理之后提取率高達40.23%。主要是火麻粕中蛋白與纖維等其他成分緊密纏繞，而研磨處理可以使顆粒變小，有利于堿液滲入對蛋白的提取；噴射蒸煮可以使物料在高溫高壓作用下，發生分子重排，使不溶性蛋白形成可溶性聚集體，從而提高了蛋白提取率。因此本試驗同時采取膠體磨與噴射蒸煮處理結合的措施來制備火麻蛋白。

注：A未預處理，B膠體磨處理，C膠體磨與熱處理。圖2 膠體磨及熱處理對蛋白提取的影響

2.2.2 料液pH值影響

Zheng等[7]通過試驗發現較高pH值可以提高蛋白的分散性和溶解性。圖3發現隨著pH值從8.0上升到10.0，蛋白提取率出現逐漸上升，從30.11%提高到46.35%。主要是pH值的增加，蛋白質所帶的靜電荷相應的增加，分子間靜電排斥力隨之增強，從而使蛋白質微粒解體；解體的蛋白質分子在高溫高壓作用下，蛋白分子重新排列形成可溶性聚集體。pH大于9時，含硫氨基酸在高溫高壓過程中，會發生分解，也會產生有毒的物質；高堿環境下使得蛋白中的酚類發生氧化，也會影響產品色澤。因此本試驗選取料液的pH為9.0。

圖3 pH值對蛋白提取的影響

2.2.3 料液比、攪拌溫度及攪拌/研磨時間影響

試驗所選的料液比(1∶10、1∶15、1∶20)對提取率影響不大，為35.00%左右；攪拌溫度(25、35、45 ℃)以及攪拌/研磨時間(60/10、90/10、60/30 min)也有類似的現象。可能原因是1∶10的料液比已經達到了物料與堿液的最大接觸面；室溫下蛋白可以充分溶解出來；60/10 min的攪拌/研磨時間可以充分的使蛋白達到最大溶解程度及使物料的微粒達到最小。故選取料液比1∶10、攪拌溫度為室溫、攪拌/研磨時間為60/10 min作為本試驗的優化條件。

2.3 火麻蛋白功能性表征

2.3.1 SDS-PAGE

圖4表明與SPI相比，火麻蛋白主要由麻仁球蛋白組成，這和Tang等[4]報道是一致的。在還原條件下與THP相比，MHP多出18.40 ku與27.01 ku 2個帶，以及少了46.30 ku帶。18.40 ku帶可能是清蛋白，這由Tang等[4]報道過；27.01 ku帶可能是醇溶蛋白，由于玉米醇溶蛋白也在這個地方呈現條帶；而MHP沒有出現46.30 ku帶，這一條帶屬于球蛋白的亞基，可能是高壓處理過程中該亞基被切斷，膜系統的分子截留為80.00 ku，從而該亞基透過了膜。電泳圖顯示THP具有更多的酸性及堿性亞基，這與圖5顯示的MHP的溶解性更好是一致的。分子質量小于14.40 ku的也是清蛋白，圖中表明MHP具有更多的清蛋白，因而溶解性較好。2種產品在濃縮膠頂部均有少量的條帶，說明除了二硫鍵之外，蛋白之間還有蛋白-蛋白及疏水相互作用。

在非還原狀態下，2類產品的條帶主要集中在濃縮膠或者分離膠的頂部，這是由于熱處理使蛋白形成了聚集體。然而THP仍然有一些酸性亞基條帶，表明其具有更多的二硫鍵。總之MHP具有更多種類的蛋白，因而其氨基酸組成更加豐富；且由于其含有的二硫鍵少，因而具有更好的溶解性。

圖4 蛋白的SDS-PAGE：帶1和1’，DDHM；帶2和2’，MHP；帶3和3’，THP

2.3.2 溶解度與持水性

如圖5所示火麻蛋白的溶解度曲線與SPI一樣，呈V型，其等電點為pH 5.0。在所有pH條件下MHP的溶解性均好于THP溶解性，表明MHP處于更自然的狀態，且會有更廣泛的工業應用。這是因為MHP具有更多的清蛋白，且酸沉過程致使某些蛋白發生聚集。pH小于7.0時，兩者的溶解性均較差，這個歸因于火麻仁球蛋白聚集的發生[8]。然而pH高于8.0時，溶解性馬上提高到65%以上，這是因為高pH條件下蛋白質的解聚[8]。

蛋白與水作用的能力取決于很多因素，比如構型、環境條件等。圖5表明蛋白的持水性與其溶解度緊密相關，它們隨pH變化而變化的趨勢是一樣的，MHP具有更好的持水性能。在等電點時蛋白/蛋白相互作用最強，因而蛋白/水相互作用變為最弱，從而導致蛋白的持水性最小。中性條件下兩者的持水性為16.00～17.00 g/g，這高于Malomo等[6]的報道(12.01 g/g)。

圖5 MHP和THP的溶解度曲線及持水性

2.3.3 乳化性與起泡性

由圖6a可知，除了pH 2.0和10.0之外，MHP具有更大的乳化活性，這或許是其具有更好的溶解性以及膜法制備的產品具有更為靈活的分子結構。然而在pH 2.0和10.0出現相反的現象，表明此條件下蛋白含量是關鍵的決定因素。兩者在pH 2.0下均具有最好的乳化活性，這可能是多酚等小分子物質在此條件下與蛋白相互作用，形成了較好的構型，從而提高其界面性質。

樣品的乳化穩定性隨著蛋白在油水界面上的強烈作用而增強[6]。圖6b顯示在pH 2.0和10.0下兩者的乳化穩定性極其高，這與乳化活性的狀況是一致的。這歸因于越高的溶解度，具備越高的靜電荷，因此具有強烈的界面相互作用。在其他pH條件下兩者的乳化穩定性差異不大，表明提取方法對其影響不大。從總體上來說，對于某種蛋白而言，其乳化性是與其溶解性呈正相關的。

圖6 MHP和THP的乳化性與起泡性

Aluko等[9]指出具有良好起泡性的蛋白具有3個條件：靈活的分子、快速吸附至汽水界面和通過相互作用重排形成穩定的界面膜。圖6c表明MHP具有更好的起泡能力，但除pH 2.0外都不及Malomo等[6]所描述的起泡能力，或許是樣品濃度和火麻種類的不同。除pH 2.0外，其余條件下兩者起泡能力隨pH變化而變化的不大。在pH 2.0時兩者的起泡能力非常大，Damodaran[10]將這歸因于樣品疏水性/親水性比例以及蛋白的聚集狀態不同。

如圖6d所示，樣品的起泡穩定性與其起泡能力相反，THP反而具有更高的起泡穩定性，表明越高的蛋白含量能形成越穩定的氣泡。這一現象與Aluko[9]和Malomo等[6]的發現是一致的，Malomo等[6]解釋這是由于越多的蛋白形成越多的界面膜來抵抗氣泡的崩解。在等電點附近樣品的起泡穩定性最大，這是由于此時溶解度降低，隨之就是靜電荷變少，蛋白之間相互排斥變弱，從而蛋白能更長時間地保留在界面上。

3 結論

以變性火麻粕為原料，探索了膠體磨等因素對火麻蛋白提取的影響，確定最佳工藝：料液比1∶10、膠體磨及攪拌時間分別為10 min和50 min、溫度為室溫、熱處理為130 ℃和90 s、pH 9.0。并利用噴射蒸煮結合超濾技術從變性脫脂火麻粕中制備了火麻蛋白，其蛋白含量與提取率分為83.21%、45.37%；其提取率顯著高于未經過膠體磨及熱處理所得的提取率(16.11%)，表明研磨及熱處理可以顯著提高蛋白的溶出率。此外超濾技術制備的火麻蛋白具有較好的功能性質。

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[10]Damodaran S. Amino acids, peptides, and proteins [M]. New York: Marcel Dekker, 1996.

Functional Characterization of Hemp Protein Produced by Jet-Cooking Combined with Membrane Ultrafiltration

Wu Junfeng1Yang Xiaoquan1Zhu Yuanzhuang2
(Research and Development Center of Food Protein, Development of Food Science and Technology,South China University of Technology1, Guangzhou 510640)(Jincheng Hanbao Bio-technology Co., Ltd2, Jincheng 048300)

The effects of colloid mill and others factors on yields of hemp protein are investigated, and the best technological condition is determined, then characterization of hemp protein produced from denatured hempseed meal by jet-cooking combined with membrane ultrafiltration are also investigated. The protein content of membrane hemp protein (MHP) and traditional acid precipitation hemp protein (THP) are 83.21% and 92.24%, respectively; the yields of them are 45.37% and 40.23%, which are significantly higher than that of hemp protein prepared without grinding and jet-cooking processes(16.11%). The gel electrophoresis shows that the compositions of MHP are more abundant and having more healthy roles. The solubility, water holding capacity and foaming capacity of MHP are better, while foaming stability is poorer. At pH 2.0 and 10.0, the emulsifying stability index of MHP and THP are much larger than that of other conditions, and the emulsifying activity index of MHP is slightly larger than that of THP except at pH 2.0 and 10.0. Thus jet-cooking combined with membrane ultrafiltration can significantly improve the yields, and the properties of that are better compared with THP.

denatured hempseed meal, hemp protein, jet-cooking, membrane ultrafiltration, phiscochemical-functional properties

國家自然科學基金(31130042、31371744)，863計劃(2013AA102208-3)

2015-08-30

吳俊鋒，男，1990年出生，碩士，糧食、油脂及植物蛋白工程

楊曉泉，男，1965年出生，教授，糧食、油脂及植物蛋白工程

TS210.9

A

1003-0174(2017)04-0058-06