酶促合成肉豆蔻酸淀粉酯的性質及結構表征

包雪梅 牛黎莉 汪 月 曾著莉 賴興娟 賈志春 張盛貴

(甘肅農業大學食品科學與工程學院，蘭州 730070)

酶促合成肉豆蔻酸淀粉酯的性質及結構表征

包雪梅 牛黎莉 汪 月 曾著莉 賴興娟 賈志春 張盛貴

(甘肅農業大學食品科學與工程學院，蘭州 730070)

為提高淀粉的反應活性，采用氫氧化鈉尿素法對馬鈴薯原淀粉進行處理，以處理后的馬鈴薯淀粉和肉豆蔻酸為原料，Novozyme 435為催化劑，在無溶劑體系中制備了取代度為0.018～0.065的肉豆蔻酸淀粉酯，并對其部分理化性質進行研究。結果表明：與原淀粉相比，預處理淀粉溶解度和透明度顯著增加(P<0.05)，其膨脹度、凍融穩定性、乳化性和乳化穩定性均顯著降低(P<0.05)。同時，肉豆蔻酸淀粉酯的性質與其取代度密切相關，與原淀粉相比，隨著取代度的增加，酯化淀粉凍融穩定性、乳化性和乳化穩定性隨之升高，而其溶解度、膨脹度和透明度隨之下降。掃描電子顯微鏡(SEM)、傅里葉紅外光譜分析(FTIR)、疏水性測定對預處理淀粉及不同取代度的肉豆蔻酸淀粉酯進行觀察、測定、分析，結果表明，淀粉顆粒結構被破壞，酯化淀粉具有較好的疏水性，FTIR驗證了預處理淀粉及酯化淀粉的生成。

酶促合成 馬鈴薯 淀粉 肉豆蔻酸淀粉酯 性質

由于馬鈴薯淀粉含有天然的磷酸基團，具有高黏性、高聚合度及其口味溫和無刺激等優點而被廣泛應用[1]，但馬鈴薯原淀粉存在冷水不溶、糊熱穩定性差及抗剪切性能差等缺點，限制了馬鈴薯淀粉的應用[2-3]。通過引入中長鏈脂肪酸，來改善淀粉的物化性質，并使淀粉具備親水親油的“雙親”性質是淀粉改性研究的熱點之一。

肉豆蔻酸即十四烷酸，屬于中長鏈脂肪酸，其價格低廉，來源廣泛，肉豆蔻酸及其衍生物廣泛應用于化妝品、高分子材料、食品等行業。目前，國內外報道的制備酯化淀粉合成方法主要有水媒法、溶劑法、熔融法等，而以脂肪酶為催化劑的合成方法則為少見[4]。酶法具有生產成本低、反應條件溫和、選擇性高、副產物少，綠色環保等優點，可廣泛應用于食品和生物制藥等行業[5]。李賀等[6]研究了以Novozyme 435作為催化劑，酶促合成松香酸淀粉酯并對不同取代度淀粉酯的理化性質進行研究。與傳統的水相和有機相酶催化相比，無溶劑體系酶催化的研究較大地擴展了酶的應用范圍，無溶劑體系中，酶直接作用于底物，提高了底物、產物濃度以及反應選擇性[7]，純化過程容易、步驟少，綠色環保[8]。Habib等[9]研究了無溶劑體系中，脂肪酶催化合成法與微波輔助法結合，合成油酸淀粉酯，并優化油酸淀粉酯合成的試驗條件。

由于氧氧化鈉/尿素混合物的水溶液能有效地破壞淀粉分子間和分子內的氧鍵作用力，使淀粉在低溫條件下與水發生糊化反應[3]，提高淀粉的反應活性。因此，本試驗選擇氫氧化鈉尿素混合溶液對馬鈴薯原淀粉進行預處理，然后以預處理淀粉和肉豆蔻酸為原料、Novozyme 435為催化劑，采用無溶劑體系酶促合成法制備取代度為0.018～0.065的肉豆蔻酸淀粉酯，并研究了其部分理化性質和結構表征。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬鈴薯淀粉：甘肅薯界淀粉有限公司；Novozym 435(活力10 000 PLU/g)：諾維信(中國)投資有限公司；肉豆蔻酸：天津市光復精細化工研究所；其他試劑或藥品均為分析純；3A型分子篩：上海山浦化工有限公司；溴化鉀：德州潤昕實驗儀器有限公司。

FTIR-650型傅里葉變換紅外光譜儀：天津港東科技發展股份有限公司；DF-Ⅱ集熱式加熱磁力攪拌器：金壇市順華儀器有限公司；UV-2450型紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；JSM-5600LV/Kevex低真空掃描電子顯微鏡：日本電子光學公司；DD-5M湘儀離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；FS-400D高速分散器：北京同德創業科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 馬鈴薯淀粉的活化預處理

馬鈴薯淀粉預處理參照Lin等[10]的方法，并加以改進。將氫氧化鈉和尿素按質量比2∶1(6 g∶3g )加入到100 mL去離子水中配制成混合溶液，并置于冰箱中冷卻至-9 ℃，快速攪拌時加入5 g干基馬鈴薯淀粉，繼續攪拌直至透明后，滴加稀鹽酸至中性，緩慢滴加95%乙醇溶液洗滌淀粉數次至無氯離子析出，再用無水乙醇洗滌脫去水分，50 ℃干燥12 h后粉碎過篩(80 目)，得到預處理馬鈴薯淀粉。

1.2.2 肉豆蔻酸淀粉酯的制備

稱取一定質量的肉豆蔻酸、Novozym 435、馬鈴薯淀粉分別置于裝有3A分子篩的3個標記好的密閉容器中靜置48 h，以平衡體系水分。稱取16 g肉豆蔻酸置于150 mL碘量瓶中，60 ℃水浴融化后，加入4 g預處理淀粉，加入占預處理淀粉(絕干)質量的0%、1%、2%、4%的Novozym 435，在60 ℃條件下以180 r/min的轉速磁力攪拌，反應期間加入一定量的3A分子篩，24 h后加入10 mL 60 ℃ 95%乙醇浸泡10 min后抽濾，用60 ℃熱無水乙醇洗滌濾餅數次，恒溫干燥至恒重，粉碎及過篩(80目)，密封貯藏，備用。

1.2.3 取代度的測定

參考王艷等[3]的測定方法，并略作改進。稱取1.50 g烘干樣品于250 mL碘量瓶中，加入25 mL蒸餾水，5 mL無水乙醇，25 mL 0.25 mol/L NaOH溶液，常溫震蕩60 min。取出，滴加酚酞指示劑，用0.1 mol/L HCl溶液滴定，滴至粉紅色剛好消失，記錄耗用鹽酸的體積數V1。同時進行空白試驗，記錄耗用鹽酸的體積數V0。肉豆蔻酸淀粉酯取代度按式(1)計算。

(1)

式中：DS為取代度；V0為滴定空白所需要的HCl量/mL；V1為滴定樣品所需要的HCl量/mL；c為標準鹽酸的摩爾濃度/mol/L；m為樣品的質量/g；211為肉豆蔻酸酰基的分子量；162為脫水葡萄糖單元的分子量。

1.2.4 傅里葉紅外光譜分析

參照Colussi等[11]的方法進行測定。

1.2.5 溶解度和膨脹度的測定

參考張燕萍[12]測定方法，并略作改進。制取質量分數為2.0%淀粉乳50 mL，于沸水浴中加熱攪拌30 min，再以3 000 r/min離心20 min，取上清液，烘干至恒重，稱重其質量為A，按照式(2)計算淀粉樣品的溶解度；下層為膨脹淀粉部分，質量為P，按照式(3)用來計算淀粉樣品的膨脹度。

(2)

(3)

式中：W為淀粉樣品質量(干基計)。

1.2.6 透明度的測定

稱取一定量的淀粉樣品，配制質量分數為1%的淀粉乳，置于100 mL燒杯中，在沸水浴中攪拌15 min至樣品完全糊化，然后自然冷卻至室溫，以蒸餾水做參照，用1 cm比色皿在620 nm波長處測定透光率[1]。

1.2.7 凍融穩定性測定

參考伍亞華等[13]和羅安[14]的測定方法，并略作改進。稱取一定量樣品，配成質量分數為3%的淀粉乳，置入沸水浴中30 min，然后冷卻至室溫后，取8 mL糊液倒入預先已稱重(G0)的10 mL離心管中，稱重G1。每個樣品分別裝12支離心管，置入-18 ℃冰箱24 h，取出室溫自然解凍6 h。從每個樣品中取出3支離心管(平行)以轉速10 000 r/min離心10 min，去上清液稱重G2，析水率按式(4)計算。在本研究中共進行4次凍融循環。

(4)

1.2.8 乳化性及乳化穩定性測定

乳狀液的制備：參考朱波等[15]的制備方法，并略作改進。稱取1.0 g樣品(干基)分散于100 mL蒸餾水中，置于沸水浴中加熱糊化20 min后得到均勻的乳液，冷卻至室溫后，于樣品糊中加入25 mL大豆色拉油，用FS-400D型高速分散器以10 000 r/min的轉速分散3 min，得到的乳狀液加入NaN3(0.02%，m/V)作為抑菌劑。

參考朱波等[15]和孫淑苗等[16]的測定方法，并加以改進。將剛剛制備好的乳狀液迅速倒入25 mL燒杯中，立即從燒杯底部5 mm處吸取乳狀液50 μL于試管中，在試管中加入5 mL 0.1%的十二烷基硫酸鈉水溶液(SDS)，混勻后于500 nm處測定吸光度值(A0)，靜置1 h后重新取樣測定吸光度值(At)，用0.1%SDS溶液做空白對照。乳化活性(emulsion ability，EA)以初始吸光值A0表示，乳化穩定性用乳化穩定指數(emulsion stability index，ESI)表示。

ESI/h=A0×Δt/ΔA

(5)

式中：A0為初始乳狀液吸光值；Δt為1 h；ΔA為1 h后吸光值與A0之差。

1.2.9 疏水性測定

準確稱取10 mg樣品(以干基計)，置于上層為石油醚(3.0 mL)，下層為蒸餾水(3.0 mL)的混合液中進行疏水性測試[17]。

1.2.10 顆粒形貌觀察

將干燥的淀粉樣品充分分散于無水乙醇中，取適量涂于玻璃片上，晾干后用導電膠黏在樣品座上，真空條件下在樣品表面蒸鍍一層10～20 mm厚的鉑金膜，然后在不同放大倍數下進行電子顯微鏡并拍攝照片[18]。

1.2.11 數據分析

每組試驗均重復3次，采用Origine 8.0、SPSS17.0等軟件對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 制備樣品取代度的測定

酶促合成肉豆蔻酸淀粉酯時發現，受酶特性影響，酶添加量對酯化反應影響較大，肉豆蔻酸淀粉酯的取代度隨著脂肪酶添加量的增加呈現先增大后降低的趨勢(圖1)。本試驗中，酶添加量為2%時，淀粉酯的DS達到最大0.065，酶濃度的提高僅僅縮短了到達反應平衡的時間，當酶濃度升高到一定程度時，再增加其濃度，取代度不僅不再明顯上升，反而有所下降。主要原因是脂肪酶發生團聚影響底物與酶活性中心的接觸[3]。后續試驗中，選擇DS為0.018、0.030、0.065的肉豆蔻酸淀粉酯與原馬鈴薯淀粉和預處理馬鈴薯淀粉進行性質測定并分析比較。

圖1 脂肪酶酶添加量對肉豆蔻酸淀粉酯取代度的影響

2.2 傅里葉紅外光譜分析

圖2 馬鈴薯原淀粉、預處理淀粉與肉豆蔻酸淀粉酯的紅外光譜

2.3 預處理、酯化對溶解度和膨脹度的影響

試驗中選擇氫氧化鈉和尿素混合溶液對原淀粉進行預處理，使其結晶部分受到破壞，解離了其雙螺旋結構，致使游離水易于滲入淀粉分子內部，極大的促進了淀粉顆粒的溶解度[20]，因此預處理淀粉溶解度(72.46%)較原淀粉(5.14%)高很多，但預處理淀粉酯化后，其溶解度降低，并且隨著淀粉酯DS的增加其溶解度顯著下降(P<0.05)(從63.85%下降到39.60%)，說明脂肪酸的引入，會使淀粉的疏水性增強，且疏水性的大小與淀粉酯化程度高低(DS大小)有關。

與溶解度相反，原淀粉的膨脹度最大(36.56%)，氫氧化鈉和尿素混合溶液處理使淀粉顆粒中螺旋結構破壞，膨脹度降低，肉豆蔻酸碳鏈的引入，使淀粉顆粒的疏水性增強，膨脹度略有增加，但不同取代度之間差異不大。

注：1：馬鈴薯原淀粉；2：預處理淀粉；3：肉豆蔻酸淀粉酯(DS=0.018)；4：肉豆蔻酸淀粉酯(DS=0.030)；5：肉豆蔻酸淀粉酯(DS=0.065)，余同。圖3 原淀粉、預處理淀粉和肉豆蔻酸淀粉酯的溶解度和膨脹度

2.4 預處理、酯化對透明度的影響

光線通過淀粉糊時，會產生折射、反射和散射現象，穿透淀粉糊的光線越多，表明糊的透明度越好[21]。如圖4所示，預處理淀粉的透明度(81.63%)較馬鈴薯原淀粉(36.62%)提高2倍多，主要是由于預處理后淀粉顆粒表面及內部結構被破壞，淀粉易與水分子締合，分散性提高了其透明度。由于酯化淀粉引入了疏水基團，阻礙了淀粉分子間及其與水分子的締合，減弱了折射和反射強度[4]，故透明度顯著下降(P<0.05)，并隨著DS的增加而降低。

圖4 原淀粉、預處理淀粉和肉豆蔻酸淀粉酯的透明度

2.5 預處理、酯化對凍融穩定性的影響

反復凍融循環試驗可用來評價淀粉糊的冷凍貯藏穩定性。由圖5可以看出，原淀粉經過一次凍融循環后，形成海綿狀結構，析水率較高，且析水率隨凍融次數增加而增大，淀粉糊失去了原來的膠體性結構變成海綿狀；預處理淀粉和酯化淀粉凍融穩定性較好，這主要是由于，氫氧化鈉尿素處理法破壞了原淀粉顆粒結構，使更多的羥基暴露，提高了淀粉和水分子間的締合，因此預處理淀粉的凍融穩定性高于原淀粉。而酯化淀粉由于疏水性碳鏈的引入，阻礙了淀粉分子間的締合，更有益于酯化淀粉的凍融穩定性，并且隨著酯化淀粉取代度的增加，凍融穩定性有較大的改善。

圖5 原淀粉、預處理淀粉和肉豆蔻酸淀粉酯的凍融穩定性

2.6 預處理、酯化對乳化性和乳化穩定性的影響

如圖6所示，馬鈴薯原淀粉經酯化后，其乳化性和乳化穩定性均得到了較大的改善，且隨著酯化淀粉取代度的增加，乳狀液的乳化性和乳化穩定性顯著提高(P<0.05)。當肉豆蔻酸淀粉酯的取代度為0.065時，其乳狀液的乳化性較馬鈴薯原淀粉增加了41%左右，乳化穩定性增加了154%左右。這主要是由于，淀粉是一種親水性高聚物，當將疏水性的中長鏈脂肪酸基團引入到淀粉分子鏈上后，淀粉便具有了一定的疏水親油性，這就使淀粉成為一種兩親性聚合物，具有很好的表面活性[3]。但是，預處理淀粉乳狀液的乳化性和乳化穩定性較原淀粉顯著降低(P<0.05)，這主要是由于氫氧化鈉尿素處理法破壞了原淀粉的顆粒結構，使更多的羥基暴露，提高了淀粉和水分子間的締合，提高了淀粉親水性的同時降低了淀粉的親油性。

圖6 原淀粉、預處理淀粉和肉豆蔻酸淀粉酯的乳化性能

2.7 預處理、酯化對疏水性的影響

利用樣品在等體積石油醚(上層)和蒸餾水(下層)中的分散量來定性分析其疏水性。由圖7可以看出，原淀粉與預處理淀粉下沉至水相中，原淀粉呈現不透明狀，預處理淀粉呈透明狀，這與2.4中透明度結果相一致。酯化后的淀粉則分散在油相和水相之間，說明脂肪酸碳鏈的引入改變了淀粉的表面極性，使親油性增加。該結果與Tupa等[17]的研究結論相一致。

圖7 原淀粉、預處理淀粉和肉豆蔻酸淀粉酯的疏水性

2.8 SEM掃描電鏡分析

由圖8可以看出，馬鈴薯原淀粉表面較光滑，顆粒大小不均勻，呈圓形或橢圓形；原淀粉經氫氧化鈉尿素混合溶液處理后，氧氧化鈉破壞了淀粉分子間和分子內氫鍵，其顆粒不能保持完整的圓形或橢圓形，表面粗糙且有破損，部分內部結構外露，該結果與王艷等[3]的研究存在差異，這主要是由于淀粉種類不同引起的。預處理淀粉經酯化后，其顆粒結構疏松且規整度差，呈現與預處理淀粉不同的形貌和結構，這說明淀粉的結晶結構在一定程度上被酯化反應所破壞，且隨著肉豆蔻酸淀粉酯取代度的增加，晶體結構破損更為嚴重，結構更為松散。

圖8 馬鈴薯原淀粉、預處理淀粉與肉豆蔻酸淀粉酯的SEM照片

3 結論

[1]孔凡真.馬鈴薯淀粉及變性淀粉的開發[J].西部糧油科技,2000,25(1):39-41 Kong Fanzhen. The development of potato starch and modified starch[J]. Grain and Oil Science and Technology in Western,2000,25(1):39-41

[2]Reddy C K,Haripriya S,Mohamed A N,et al.Preparation and characterization of resistant starch III from elephant foot yam (Amorphophalluspaeonifolius) starch[J].Food Chemistry,2014,155:38-44

[3]王艷.中長鏈脂肪酸淀粉酯的酶法合成及其性質研究[D].哈爾濱：哈爾濱商業大學,2013 Wang Yan.Enzymatic synthesis and properties of medium long chain fatty acid starch ester[D].Haerbin:Haerbin University of Commerce,2013

[4]Aburto J,Alric I,Thiebaud S,et al.Synthesis,characterization,and biodegradability of fatty-acid esters of amylose and starch[J].Journal of Applied Polymer Science,1999,74(6):1440-1451

[5]王艷,辛嘉英,劉鐵,等.無溶劑體系酶催化油酸淀粉酯的合成[J].中國糧油學報,2012,27(11):39-44 Wang Yan, Xin Jiaying, Liu Tie,et al.Enzymatic synthesis in solvent-free system of oleic acid starch ester[J].Journal of the Chinese Cereals and Oils Association,2012,27(11):39-44

[6]李賀,林日輝,栗佳婷,等.酶促酯化制備松香酸淀粉酯的性質及結構表征[J].化工學報,2014,65(10):4123-4130 Li He, Lin Rihui, Li Jiating, et al.Properties and structure of rosin acid starch ester prepared by enzyme catalysis[J]. Journal of Chemical Industry,2014,65(10):4123-4130

[8]張少科.酶促合成硬脂酸淀粉酯及其性質研究[D].天津：天津科技大學,2011 Zhang Shaoke.Study on enzymatic synthesis and properties of starch stearate[D].Tianjin: Tianjin University of Science and Technology,2011

[9]Habib Horchani,Moncef Chaabouni,Youssef Gargouri,et al.Solvent-free lipase-catalyzed synthesis of long-chain starch esters using microwave heating:Optimization by response surface methodology[J].Carbohydrate Polymers,2010,79(4):466-474

[10]Lin R,Li H,Long H,et al.Structure and characteristics of lipase-catalyzed rosin acid starch[J].Food Hydrocolloids,2015,43:352-359

[11]Colussi R,Pinto V Z,El Halal S L M,et al.Structural,morphological,and physicochemical properties of acetylated high-,medium-,and low-amylose rice starches[J].Carbohydrate polymers,2014,103:405-413

[12]張燕萍.變性淀粉制造與應用[M].北京：化學工業出版社,2007 Zhang Yanping.The manufacture and applications of modified starch[M].Beijing:Chemical Industry Press,2007

[13]伍亞華,石亞中.交聯-羧甲基淀粉糊性質研究[J].食品與機械, 2008(11):16-19 Wu Yahua, Shi Yazhong.Study on the paste properties of crosslinking carboxymethyi starch[J]. Food and Machinery,2008(11):16-19

[14]羅安.馬鈴薯羥丙基-羧甲基復合變性淀粉的制備及其性能研究[D].蘭州：甘肅農業大學,2013 Luo An. Study on the preparation and properties of cross-linked carboxymethyl potato starch[D].Lanzhou: Gansu Agricultural University ,2013

[15]朱波,蔣將,李進偉,等.三種不同脂肪酸組成的油脂乳化液的理化性質研究[J].食品工業科技,2013,34(14):103-107 Zhu Bo,Jiang Jiang, Li Jinwei,et al.Study on the physicochemical properties of three kinds of different fatty acid composition of the oil emulsion[J].Food Industry Science and Technology,2013,34(14):103-107

[16]孫淑苗,薛冬樺,譚穎,等.淀粉辛酸酯的制備及其乳化性能的研究[J].精細化工,2011,28(2):120-124 Sun Shumiao, Xue Donghua, Tan Ying, et al.Preparation of starch octanoate ang its emulsifying properties[J]. Fine Chemicals,2011,28(2):120-124

[17]Tupa M V,Ramírez J A,Vázquez A,et al.Organocatalytic acetylation of starch:Effect of reaction conditions on DS and characterisation of esterified granules[J].Food Chemistry,2015,170:295-302

[18]牛黎莉,張盛貴,郭奕喬,等.微波濕熱處理對馬鈴薯抗性淀粉含量及性質的影響[J].食品工業科技,2013,14(34):156-159 Niu Lili, Zhang Shenggui, Guo Yiqiao, et al.Effect of microwave heat-moisture treatment on resistant starch content and properties of potato starches[J]. Science and Technolog,2013,14(34):156-159

[19]Biswas A,Shogren R L,Selling G,et al.Rapid and environmentally friendly preparation of starch esters[J].Carbohydrate Polymers,2008,74(1):137-141

[20]耿鳳英.預處理對淀粉結構及化學反應活性的影響[D].天津：天津大學,2010 Gen Fengying. Influence of pretreatment on structure and chemical reaction activity of starch[D].Tianjin: Tianjin University ,2010

[21]李兆豐,顧正彪.酸解氧化淀粉的制備及其性質的研究[J].食品與發酵工業,2005,31(2):14-17 Li Zhaofeng, Gu Zhengbiao.Researches on the preparation and properties of acid-thinned ang oxidized starch[J].Food and Fermentation Industries, 2005,31(2):14-17.

Properties and Structure of Myristate Acid Starch Esters Prepared by Lipase

Bao Xuemei Niu Lili Wang Yue Zeng Zhuli Lai Xingjuan Jia Zhichun Zhang Shenggui
(College of Food Science and Engineering, Gansu Agriculture University, Lanzhou 730070)

To improve the reactivity of starch, NaOH/urea was used to treat the potato starch and the treated potato starch and nutmeg acid were taken as raw materials. In the solvent-free system, substitution starch myristate(DS=0.018～0.065) was prepared using Novozyme 435 as catalyst, and its physicochemical characters were also studied. The results showed that compared with native potato starch, the solubility and the transparency of pretreated starch significantly increased (P<0.05), but the swelling power, freeze-thaw stability, emulsion ability and emulsion stability index significantly reduced (P<0.05). Meanwhile, comparing with native potato starch, the increase of DS, the swelling power, freeze-thaw stability and emulsion stability index increased; but the solubility, emulsion ability and transparency decreased. The pretreated starch and the myristate acid starch esters with different DS were characterized by SEM, FTIR, and the determination of hydrophobic. The results indicated that the structure of starch granule was destroyed, esterified starch had good hydrophobicity compared with the native starch, and the generation of pretreated starch and esterified starch was verified by FTIR.

enzymatic synthesis, potato starch, starch myristate, properties

甘肅省農業生物技術研究與應用開發(GNSW-2014-10)，甘肅省農業科技創新(GNCX-2012-43)

2015-09-22

包雪梅，女，1991年出生，碩士，農產品加工及貯藏工程

張盛貴，男，1970年出生，教授，淀粉深加工

S532

A

1003-0174(2017)04-0052-07