慢病毒介導的EphrinB2基因轉染大鼠骨髓間充質干細胞表達的實驗研究

朱 敏， 徐 運， 張 躍， 湯 健， 華 裕， 趙曉科， 杜森杰

慢病毒介導的EphrinB2基因轉染大鼠骨髓間充質干細胞表達的實驗研究

朱 敏1， 徐 運2， 張 躍1， 湯 健1， 華 裕1， 趙曉科1， 杜森杰1

目的 將攜帶EphrinB2基因慢病毒轉染至骨髓間充質干細胞(BMSCs)，檢測其過表達水平及細胞形態學變化，并探討EphB4/EphrinB2是否具有促進大鼠BMSCs體外遷移活性的作用。方法 單純貼壁法分離大鼠BMSCs，倒置顯微鏡觀察細胞生長形態。攜帶EphrinB2慢病毒以感染復數3和10感染BMSCs分為低濃度轉染組(MOI=3)和高濃度轉染組(MOI=10)，對照組采用未轉染組、陰性轉染組，利用qPCR檢測EphrinB2基因表達及Western blot檢測EphrinB2蛋白水平。觀察EphrinB2基因轉染后BMSCs形態學變化。15 d后通過免疫熒光檢測MAP2表達了解細胞分化。進一步Transwell實驗檢測細胞遷移能力來了解EphB4/EphrinB2在調節干細胞遷移的作用。結果 培養BMSCs為多角形或棱形呈漩渦狀排列生長。EphrinB2-BMSCs經qPCR和Western blot檢測證實有外源性EphrinB2表達。EphrinB2基因轉染后BMSCs 24 h，BMSCs胞體開始收縮細胞有突起伸出,72 h后可見典型的神經樣細胞形態改變。15 d后，BMSCs分化成為MAP2神經元，與陰性轉染組相比，低濃度轉染組和高濃度轉染組MAP2表達率上升(P< 0.05)。Transwell實驗結果顯示：低濃度轉染組與高濃度轉染組較未轉染組及陰性轉染組穿膜細胞數量明顯增加(P<0.05)。結論 慢病毒介導EphrinB2能高效感染BMSCs,并隨著時間延長分化成神經樣細胞，同時EphB4/EphrinB2在調節BMSCs遷移具有重要作用。

EphrinB2; EphB4； 骨髓間充質干細胞； 神經干細胞； 遷移

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSCs)是存在于骨髓中明顯有別于造血干細胞的一類前體細胞。體內外研究發現，在特定環境下BMSCs在適宜誘導劑、細胞因子等作用下可被誘導分化為神經元樣細胞等；而且與胚胎神經發生、神經干細胞成熟、遷移方式一致，趨向游走定位性準確[1,2]。最新研究發現紅細胞生成素肝細胞受體(erythropoietin-producing hepatocelluar receptor,Eph受體)是最大酪氨酸激酶受體家族，其配體主要表達于細胞表面，被命名為ephrin(eph family receptor interacting protein)。兩者均為膜結合蛋白，相互依賴進行信號轉導，具有神經軸突導向、細胞粘附、促進干細胞增殖、遷移和血管新生，已成為國際上干細胞研究的熱點。Eph受體可分為兩類：Eph A (Eph A1-10)和Eph B(Eph B1-Eph B6),與Eph受體結合的配體稱為Ephrin,也分為兩類：Ephrin A(Ephrin A1-6)和EphrinB(Ephrin B1-B3)[3]。但關于EphB4/EphrinB2在干細胞中的作用及其機制目前國內外報道均較少。有別于其他酪氨酸激酶受體，EphB4和EphrinB2之間的信號轉導途徑是雙向的，在信號轉導過程中二者均可被對方激活，產生“正向信號”和“反向信號”。以EphB4為配體結合EphrinB2后，快速募集SFKs(Src-family kinases)到EphrinB2附近，將EphrinB2酪氨酸殘基磷酸化，然后與接頭蛋白Grb4的SH2結構域相結合激活下游信號通路，為反向信號通路[4,5]。研究表明，激活的反向信號產生促內皮細胞黏附、遷移和促血管出芽等促進血管新生的作用[6]。因此本研究通過體外實驗培養BMSCs，構建過表達EphrinB2慢病毒載體，慢病毒感染 BMSCs，使EphrinB2目的基因在BMSCs中持續表達，通過體外實驗觀察轉染EphrinB2后其對BMSCs遷移能力的影響，旨在為轉染EphrinB2增效干細胞應用于臨床提供新的理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料 (1)實驗動物健康雄性無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級Sprague-Dawley(SD)大鼠10只，均由南京醫科大學實驗動物中心提供;(2)主要試劑包括Trizol試劑(美國Invitrogen公司產),病毒包裝3質粒：LV重組載體系列(過表達大鼠EphrinB2慢病毒載體)和綠色熒光蛋白EGFP(上海吉凱基因化學有限公司),胎牛血清和DEME高糖培養基(美國Gibco公司),EphrinB2多克隆抗體(英國abcam公司)，兔抗微管相關蛋白2(MAP2)多克隆抗體(Proteintech 公司)；Transwell小室(美國Millipore公司)，Cy3標記山羊抗小鼠IgG(H+L)，RNA提取試劑盒(康為)，RT-PCR試劑盒(Oligo公司)， L-多聚賴氨酸和噻唑藍(美國Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠BMSCs分離、純化及擴增 單純貼壁法分離大鼠BMSCs分離獲取BMSCs，具體步驟見參考文獻[2]。

1.2.2 EphrinB2慢病毒載體的構建 構建過表達大鼠EphrinB2慢病毒載體，含有EGFP 標記。產生病毒液并采用孔稀法測定滴度。最后將制備好慢病毒載體放至-80 ℃冰箱凍存備用。

1.2.3 轉染復數值測定 取培養3代以上的大鼠BMSCs，以1×105/孔的密度接種至24孔板。培養2～3 d，直至細胞融合度達50%左右，按2個不同MOI值為(3、10)添加病毒液和終質量濃度為5 mg/L的聚凝胺。陰性轉染組只添加含有EGFP空病毒上清，轉染組添加MOI值為3.0和10.0 EphrinB2慢病毒載體上清和EGFP,終質量濃度為5 mg/L的Polybrane被添加到以上3組，而未轉染組不做處理。共轉染12 h后更換新鮮培養基。轉染后每天在倒置熒光顯微鏡下觀察各組細胞綠色熒光蛋白表達情況，評估轉染效率，篩選最適轉染復數值。

1.2.4 大鼠BMSCs轉染及實驗分組 根據轉染情況將同時點的大鼠BMSCs分為4組：未轉染組(不進行轉染，其他培養條件同各轉染組);陰性轉染組(轉染空白慢病毒);低濃度轉染組(轉染LV-rno- EphrinB2-3moi，含EphrinB2-3moi慢病毒);高濃度轉染組(轉染LV-rno- EphrinB2-10moi，含EphrinB2-10moi慢病毒)，每組設3個重復孔。在倒置熒光顯微鏡下觀察轉染24 h、48 h、72 h EGFP熒光表達情況。

1.2.5 采用qPCR檢測BMSCs EphrinB2mRNA水平 用Triol試劑提取細胞總RNA，逆轉錄采用cDNA合成試劑盒，具體操作參照說明書完成。用美國Bio-Rad公司生產的MJ Mini Opticon型實時PCR儀進行熒光定量PCR擴增。結果由分析軟件自動進行統計和計算。引物序列：GAPDH mRNA F的序列為5’-gtgaggtgaccgcatcttct-3’,GAPDH 的序列mRNAR的序列為5’-cttgccgtgggtagagtcat-3’,PCR產物大小為353 bp;EphrinB2 mRNA F的序列為5’-gacgtccagaactagaagctgg-3’,EphrinB2 mRNA R的序列為5’-caccatccaatggaagcctgg-3’,PCR產物大小為257 bp。

1.2.6 采用Western blotting檢測BMSCs EphrinB2蛋白水平 電轉移100 min至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)，于5%脫脂奶粉封閉測定BMSCs EphrinB2的蛋白表達水平，取等量的細胞裂解液(含細胞蛋白70 μg)上樣行電泳。電泳條件：濃縮膠恒壓80 V,約30 min分離膠恒壓100 V,約90 min。恒流200 mA液中封閉(室溫，4 h),加入封閉液和適量EphrinB2抗體孵育過夜。用含5%脫脂奶粉的洗滌液(tris-buffered saline and tween,TBST)漂洗后，將膜與辣根過氧化酶標記的二抗于室溫下搖蕩孵育2 h，經TBST充分洗膜后，利用增強化學發光法(enhanced chemiluminescence,ECL)顯色成像。相應蛋白表達值-條帶的灰度值/actin。

1.2.7 體外誘導BMSCs誘導分化為神經干細胞 取各組細胞進行誘導實驗，取傳至第3代BMSCs,待其長滿后加入0.25%胰蛋白酶消化10 min,清棄胰酶,按 5×107L-1接種于含60 g/L葡萄糖、20 μg/L堿性成纖維細胞生長因子、20 μg/L表皮生長因子、2%B27的DMEM/F12(1∶1)誘導培養液進行誘導,根據細胞生長情況換液，傳代，倒置相差顯微鏡下觀察。

1.2.8 BMSCs分化為神經元樣細胞的鑒定 加入培養15 d后，對 BMSCs進行免疫細胞熒光染色檢測。所使用抗體及抗體稀釋濃度為： MAP2 (1∶500)、4， 6 二氨 - 苯基吲哚(DAPI)稀釋濃度為(1∶1000)。

1.2.9 遷移實驗 Transwell實驗檢測細胞遷移能力來了解EphB4/EphrinB2在調節干細胞遷移的作用。取出小室，用棉簽擦去上室內的細胞，用無水乙醇固定細胞30 min，風干。用0.1%結晶紫染色10 min,于倒置顯微鏡下觀察。隨機選取10個視野，進行細胞計數。

2 結 果

2.1 EphrinB2過表達慢病毒載體的構建 EphrinB2上調慢病毒陽性重組克隆均通過測序，證明載體構建成功。LV-rno-EphrinB2病毒滴度為1×109TU/ml，陰性對照病毒滴度為1×109TU/ml。

2.2 EphrinB2過表達慢病毒轉染 通過倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達情況評價細胞轉染率。慢病毒轉染BMSCs 24 h，均可見綠色熒光蛋白陽性細胞但數量較少，且胞漿內熒光較弱，間隔1 d重復感染，72 h后見綠色熒光蛋白EGFP陽性細胞增多，熒光增強，此時表達最佳，其中MOI=3時陽性細胞數量及熒光強度最優,且對BMSCs的細胞形態無明顯影響。低濃度轉染組和高濃度轉染組與陰性轉染組EGFP轉染率無明顯差異(見圖1)。

2.3 對BMSCsEphrinB2 mRNA轉錄的影響 qPCR結果顯示，陰性轉染組EphrinB2 mRNA轉錄水平與未轉染組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。低濃度轉染組和高濃度轉染組EphrinB2 mRNA轉錄水平高于陰性轉染組與未轉染組(P<0.05),低濃度轉染組EphrinB2 mRNA的轉錄水平高于高濃度轉染組(P<0.05)(見圖2)。

2.4 BMSCs EphrinB2蛋白水平的影響 Western blotting結果顯示陰性轉染組EphrinB2蛋白與未轉染組相比較，差異無統計學意義(P>0.05)。低濃度轉染組和高濃度轉染組EphrinB2蛋白水平高于陰性轉染組與未轉染組(P<0.05),低濃度轉染組EphrinB2蛋白表達水平高于高濃度轉染組(P<0.05)(見圖3)。

2.5 免疫熒光檢測 加入5 μg/L FGF、EGF15 d后，低濃度轉染組和高濃度轉染組MAP2蛋白表達顯著上調，高于陰性轉染組與未轉染組(P<0.05),低濃度轉染組與高濃度轉染組MAP2的蛋白表達水平兩者間沒有明顯的統計學差異(P>0.05)(見圖 4)。

2.6 Transwell實驗檢測 采用Transwell實驗研究EphrinB2基因對干細胞遷移能力的影響,實驗結果顯示：低濃度轉染組穿膜細胞數量(134±6.53)與高濃度轉染組(130±4.57)和較未轉染組(101±4.32)及陰性轉染組(102±5.08)顯著減少(P<0.05)，而未轉染組與陰性轉染組兩組間相比較無顯著差異(P>0.05)(見圖 5)。

A：未轉染組;B:陰性轉染組;C:低濃度轉染組;D:高濃度轉染組

圖1 倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白

與未轉染組與陰性轉染組相比*P<0.05;與低濃度轉染組相比#P<0.05

圖2 RT-PCR 檢測 EphrinB2 mRNA 表達水平

圖3 Western blot檢測EphrinB2蛋白的表達水平

A：未轉染組;B:陰性轉染組;C:低濃度轉染組;D:高濃度轉染組

圖4 免疫熒光檢測 MAP2的表達

與未轉染組與陰性轉染組相比*P<0.05

圖5 慢病毒介導的EphrinB2基因對BMSCs細胞遷移能力的影響

3 討 論

BMSCs具備明顯的自我復制更新和多分化潛能，且因其在體外容易獲得和擴增，相較于胚胎干細胞、臍血干細胞，倫理學限制較少，易于實驗室工作的大范圍展開。體外研究發現，在特定環境下，BMSCs能被誘導分化為成骨細胞、神經細胞、血管內皮細胞[7]。

新近研究發現，EphB4/EphrinB2系統和其特異雙向信號傳導在神經細胞粘附和遷移的作用顯得尤為重要，而且與干細胞移植密切相關。Ephrin B2來自于受體酪氨酸激酶家族(RTKs)中最大的亞族Eph家族。EphB4/EphrinB2均為跨膜蛋白，Eph包含3個部分：含一個N端球樣配體結構域、一個富含半胱氨酸的區域和兩個Ⅲ型纖維連接蛋白的胞外區，胞膜區，含一個分布酪氨酸激酶的結構域、高度保守的SAM結構域和一個 PDZ結構域的胞內區，Ephrin B2也包含3個部分：含一個保守的C端尾(含酪氨酸激酶結合位點)和PDZ結構域胞內區、胞膜區、由GPI 聯接的與受體結合的胞外區，Ephrin B2通過其胞外部分與Eph受體相結合使Eph胞內酪氨酸激酶結合位點發生磷酸化激活下游通路，同時自身胞內部分也發生酪氨酸激酶的磷酸化而游活下游通路形成Eph-ephrin系統特有雙向信號傳導通路，EphB4/EphrinB2的雙向信號通路使它們在細胞排斥和粘附具有重要地位和作用[8]。Sentarkz在Nature雜志上報道關于EphrinB2基因在胚胎期誘導血管內皮細胞遷移方面的作用[9]。還有相關文獻報道能在胚胎期誘導神經脊細胞的目的遷移，促進嗅覺和聽覺等諸多器官的胚胎發育。Kemmerling發現γ分泌酶通過刺激反向EphrinB2信號通路在小鼠胚胎干細胞衍生的小膠質細胞促進遷移[10]。目前關于EphrinB2在血管生成和遷移地位和作用存在一定爭議，但是大多數研究傾向于經EphrinB2介導反向信號傳導通路促進血管內皮細胞侵襲、遷移和管腔形成，產生促進血管生成效應，而且與干細胞移植密切相關。Conover 等報道，EphrinB2信號傳導可能在突觸水平對這一過程進行調控，EphrinB2在側腦室旁具有分化功能的神經干細胞上表達，用EphB4或EphrinB2灌注側腦室3 d可打破神經干細胞的遷移和細胞增殖。這一切證明EphrinB2基因可能直接或間接調節著側腦室下區神經干細胞的增殖、分化和遷移[11]。我們用qPCR和Western blot檢測4組細胞EphrinB2 mRNA和蛋白表達水平結果顯示：與未轉染組、陰性轉染組比較低濃度轉染組和高濃度轉染組EphrinB2 mRNA與蛋白表達水平均明顯增加，提示我們篩選建立穩定表達細胞株。

我們用FGF、EGF誘導BMSCs能顯著增加向神經元方向的分化。并且發現低濃度轉染組和高濃度轉染組MAP2蛋白表達顯著上調，高于陰性轉染組與未轉染組，提示EphrinB2基因在神經干細胞向神經元分化和遷移過程中的早期中起到正調控作用。為了進一步研究EphrinB2基因在調節干細胞遷移的作用中，我們用Transwell實驗檢測各組細胞遷移情況。低濃度轉染組和高濃度轉染組較陰性轉染組及未轉染組明顯增加，而陰性轉染組及未轉染組兩組間相比較差異無統計學意義，綜合上述實驗結果提示： EphrinB2基因使其體外遷移能力顯著增加，證實EphrinB2基因對在調節BMSCs遷移具有重要作用。

綜上所述：利用慢病毒過表達EphrinB2基因可在體外促進大鼠BMSCs分化和遷移，本實驗研究提示EphB4/EphrinB2在調節BMSCs遷移具有重要作用。這為深入研究EphB4/EphrinB2在調節BMSCs分子生物學機制具有重要的生物學作用，為尋找基因治療的有效靶點提供了理論依據和實驗基礎。

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Experimental study of lentiviral vector-mediated EphrinB2 gene transfection rat bone marrow mesenchymal stem cells

ZHUMin,XUYun,ZHANGYue,etal.

(DepartmentofNeurologyandRehabilitation，NanjingChildren’sHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210008,China)

Objective To detect the over-expression and morphological changes after EphrinB2 gene transfected to BMSCs and study the effect of EphB4/EphrinB2 on rat BMSCs in vitro.Methods The simple adherent method was adopted in isolating and culturing experiments of BMSCs.The inverted microscope was used to observe cells.Lentivirus carrying EphrinB2 infected BMSCs(MOI=10) and (MOI=3),using qPCR and Western blot to detect mRNA and protein’s expression of EphrinB2 after transfection.Morphological changes of BMSCs after differentiation was observed.In 15 days，the cell differentiation was determined by MAP2 immunofluorescent staining.The migration rate was assessed to study the role of EphB4/EphrinB2 pathway in the stem cells migration by transwell chambers.Results The morphological characteristics of major of the BMSCs were unified into polygonal or fusiform,germinated into a spiral shape.We confirmed exogenous EphrinB2 expression in EphrinB2-BMSCs by qPCR and Western blot.3 days after EphrinB2 gene transfection,BMSCs cell body began to shrink,refraction enhanced cell protrusions,and differentiate into the typical neuron-like cell,qPCR and Western blot detection of nestin positive expression.In 15 days,expression levels of MAP2 in the low and high concertration transfected group were significantly higher than those in the negative control group (P<0.05).Transwell assay showed the cell number of Transmembrane in the low and high concertration transfected group were obviously higher compared to non-transfected group and negative control group (P<0.05).Conclusion Lentiviral-mediated EphrinB2 can efficiently infect BMSCs,and differentiate into neuron-like cells.EphB4/EphrinB2 pathway can play the role of migration in bone mrrow mesenchymal stem cells.

EphrinB2； EphB4； Bone mrrow mesenchymal stem cells； Neural stem cell; Migration； BMSCs

1003-2754(2017)06-0508-04

2017-02-18；

2017-05-25

國家自然科學基金青年基金(No.81401864)；南京醫科大學科學基金重點項目(No.2013NJMU097)

(1.南京醫科大學附屬兒童醫院康復科，江蘇 南京 210008；2.南京大學醫學院附屬鼓樓醫院神經內科，江蘇 南京 210008)

朱 敏,E-mail:1553526445@qq.com

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