高效液相色譜法測定發酵液中的D-核糖與葡萄糖

崔鳳杰，胡婉君，周玨，孫文敬，魏轉，徐勤華，劉長峰

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江212013；2.河北化工醫藥職業技術學院，河北石家莊050026；3.山東德普化工科技有限公司，山東泰安271200）

高效液相色譜法測定發酵液中的D-核糖與葡萄糖

崔鳳杰1，胡婉君1，周玨1，孫文敬1，魏轉2，徐勤華3，劉長峰3

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江212013；2.河北化工醫藥職業技術學院，河北石家莊050026；3.山東德普化工科技有限公司，山東泰安271200）

以RID為檢測器，建立高效液相色譜法定量測定發酵液中葡萄糖和D-核糖的方法。該方法的測定條件為：柱型Shodex Suger SH1011，流動相為0.005 mol/L的稀硫酸溶液，柱溫為50℃，進樣量為10 μL。底物葡萄糖和產物D-核糖的出峰時間分別為11.573 min和13.313 min。得到底物葡萄糖和產物D-核糖的回歸方程分別為Y=6.868 4X-0.069 1和Y=6.556 5X+0.004 6，其中Y為葡萄糖或D-核糖的質量濃度，X為對應的峰面積。線性范圍在2 g/L～45 g/L時，該法精密度、穩定性和重現性均良好；葡萄糖的平均回收率為99.27%，D-核糖的平均回收率為99.61%，RSD值分別為0.38%和0.14%，說明本方法準確可行。

D-核糖；高效液相色譜法；糖類檢測

D-核糖又稱D-呋喃核糖，是一種功能性的五碳糖，廣泛存在于核糖核酸、NAD、NADP及FAD等中，具有抗衰老、調節體內血糖、血脂含量等功能[1-3]。D-核糖也是諸多藥物或食品添加劑合成的中間體和平臺化合物[4-5]。在工業生產中，D-核糖的發酵底物一般為淀粉水解糖，其主要成分為葡萄糖。因此，在微生物發酵生產D-核糖過程中，主要涉及底物葡萄糖和產物D-核糖的檢測和分析。目前，國際上公認的D-核糖的檢測方法主要有苔黑酚法[6]和HPLC法。苔黑酚法[7]雖然有較高的實用性和經濟性，但樣品的處理過程比較復雜，檢測時間也偏長，并且樣品中的葡萄糖對檢測結果的干擾性較大，可能會導致測定誤差較大。近年來，相關的國外文獻中有關D-核糖的檢測方法均為HPLC法[8-10]。

本文研究了HPLC-RID法同時檢測發酵液中D-核糖和葡萄糖，并對其進行方法學考察[11-14]，為建立快速、簡便、準確的D-核糖和葡萄糖的定量分析方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Agilent1100型高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；FA1004型電子分析天平：上海越平科學儀器有限公司；SW-CJ-2F型雙人雙面垂直凈化工作臺：上海博迅實業有限公司；YXQ-WF32型臥式方形壓力蒸汽滅菌鍋：天水華圓醫療器械有限公司；HYL-C型組合式搖床：太倉市強樂試驗設備有限公司；DHP-9272型電熱恒溫培養箱：上海一恒科技有限公司；TGL-18M型臺式高速冷凍離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司。

菌種：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）UJS0717：江蘇大學生物工程研究所選育并保藏。

D-核糖發酵液：江蘇大學生物工程研究所自制；D-核糖：純度≥99%，Sigma-Aldrich；葡萄糖、硫酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；甲醇：色譜級，美國Tedia公司；純凈水：杭州娃哈哈集團。

1.2 方法

1.2.1 培養基制備

斜面培養基（g/L）：山梨醇 5，蛋白胨 10，NaCl 2，酵母膏2，瓊脂20，用1 mol/L的 HCl或1 mol/L的NaOH溶液調節pH至7.0。該培養基用于菌種保藏及活化。

種子培養基（g/L）：葡萄糖 20，酵母膏 3，K2HPO43，KH2PO41，用1 mol/L的HCl或1 mol/L的NaOH溶液調節pH至7.0。該培養基用于發酵種子液的制備。

發酵培養基（g/L）：玉米淀粉水解液120 g/L（以葡萄糖計），玉米漿 15，（NH4）2SO47.5，酵母粉 1.0，MnSO4·H2O 0.05，CaCO320。用5 mol/L的HCl或NaOH溶液調節pH至7.0。該培養基用于發酵生產D-核糖。

1.2.2 菌種活化及保藏

將配好的斜面培養基在121℃下滅菌20 min，待冷卻后接入一環菌種，并置于36℃的恒溫培養箱中培養24 h。可將培養好的斜面放置于4℃的冰箱中保藏。

1.2.3 種子培養

挑取試管中的一環菌種接至種子培養基中（每250 mL錐形瓶中裝20 mL種子培養基），在36℃、240 r/min組合式搖床上培養20 h。

1.2.4 D-核糖發酵液制備

將培養好的種子液按照10%的接種量，接種至裝有20 mL發酵培養基的250 mL錐形瓶中進行發酵，在36℃、240 r/min組合式搖床上培養。

1.2.5 D-核糖和葡萄糖標品溶液制備

準確稱取適量的D-核糖標品（純度≥99%）和葡萄糖標品（純度99%），用0.005 mol/L的稀硫酸溶液配制成不同濃度的D-核糖和葡萄糖混合標準品溶液，稀釋成的濃度分別為 2、4、5、6、8、10、15、30、45 g/L。

1.2.6 HPLC條件

色譜柱：ShodexSugerSH1011（8.0mmI.D×300mm）；流動相：0.005 mol/L的稀硫酸溶液；流速：0.6 mL/min；檢測器：示差檢測器；柱溫：50℃；進樣量：10 μL。

1.2.7 D-核糖發酵液樣品預處理

利用臺式高速離心機，將D-核糖的發酵液在4 200 r/min下離心15 min，來除去菌體和其他雜質，并將上清液稀釋適當倍數后用0.45 μm的水系微孔濾膜過濾后備用。

1.2.8 數據處理

2 結果與討論

2.1 D-核糖和葡萄糖的標準曲線及回歸方程

先分別將葡萄糖和D-核糖的標品溶液進行HPLC分析，再在相同的條件下對底物葡萄糖和產物D-核糖的混合標準品進行分析，結果如圖1和圖2所示。從圖中可以看出，葡萄糖的保留時間為11.573 min，D-核糖的保留時間為13.313 min。

相同色譜條件下，用HPLC依次測定濃度為2、4、5、6、8、10、15、30、45 g/L 的 D-核糖和葡萄糖的混合標準品溶液，并記錄不同的峰面積。再對混合液的色譜圖峰面積測定結果進行線性回歸，得到的葡萄糖線性回歸方程為：Y=6.868 4X-0.069 1；D-核糖的線性回歸方程為：Y=6.556 5X+0.004 6，式中Y為葡萄糖或D-核糖的質量濃度（g/L），X為對應的峰面積。葡萄糖的線性回歸方程的決定系數R2=0.999 9，D-核糖的線性回歸方程的決定系數R2=0.999 8，t檢驗和F檢驗的結果都表示為顯著，說明葡萄糖和D-核糖在質量濃度為2 g/L～45 g/L的范圍內都成良好的線性關系，葡萄糖和D-核糖的標準曲線如圖3和4所示。

2.2 精密度試驗

隨機抽取一組樣品溶液來進行精密度的測定。用HPLC對該樣品進行連續重復測定5次，并記錄峰面積值，并計算相對標準偏差RSD，具體結果如表1所示，葡萄糖和D-核糖的RSD值分別為0.68%和0.84%，表明本方法精密度良好。

圖1 葡萄糖和D-核糖標準品的HPLC圖Fig.1 HPLC spectrum of glucose and D-ribose standands

圖2 葡萄糖和D-核糖混合標準品的HPLC圖Fig.2 HPLC spectrum of mixed glucose and D-ribose standards

圖3 高效液相色譜測定葡萄糖的標準曲線Fig.3 Standard curve of glucose determined by HPLC

圖4 高效液相色譜測定D-核糖的標準曲線Fig.4 Standard curve of D-ribose determined by HPLC

表1 精密度結果Table 1 Precision of experiment results

2.3 穩定性試驗

穩定性結果見表2。將樣品溶液在室溫下放置0、1、2、3、4 h后，在相同的色譜條件下用HPLC測定其峰面積值。再根據相應的線性回歸方程來計算樣品溶液中的葡萄糖和D-核糖的質量濃度，其RSD值分別為1.89%和1.94%，由表2分析可知樣品溶液在4 h內的穩定性良好。

表2 穩定性結果Table 2 Stability of experiment results

2.4 重現性試驗

取5份相同的D-核糖發酵液，在相同的色譜條件下，用HPLC測定并記錄峰面積值。依據線性回歸方程計算發酵液中葡萄糖和D-核糖的質量濃度，其RSD值分別為1.23%和1.17%，結果發現本法重現性較好（表 3）。

表3 重現性結果Table 3 Reproducibility of experiment results

2.5 加標回收率

加標回收率是檢驗待測樣品在前處理和儀器檢測中的損失情況，以此來評估檢測方案的可行性。準確吸取5份體積為25 mL，葡萄糖和D-核糖的質量濃度分別為26.35 g/L和20.21 g/L的D-核糖發酵液于50 mL的容量瓶中，分別向這5份溶液中加入5 mL的葡萄糖和D-核糖的質量濃度都為2.0 g/L的標準品混合溶液。用0.005 mol/L的稀硫酸溶液定容至50 mL后，用HPLC測定并記錄各峰面積值，再依據線性回歸方程來計算溶液中葡萄糖和D-核糖的質量濃度。結果如表4所示，葡萄糖的平均回收率為99.27%，D-核糖的平均回收率為99.61%，RSD值分別為0.38%和0.14%，說明本方法準確可行。

表4 加標回收率結果Table 4 Recovery rates of experiment results

3 結論

本文以RID為檢測器，建立了HPLC-RID同時定量檢測了發酵液中D-核糖和葡萄糖的方法，方法簡便、準確、靈敏度高，穩定性和重現性好。所采用的色譜條件可將底物葡萄糖和產物D-核糖有效分離，顯著減少了葡萄糖對D-核糖檢測結果的干擾。該方法的建立為同時定量分析發酵液中D-核糖和葡萄糖和準確評價生產菌株的葡萄糖利用效率和D-核糖合成得率提供了技術支持。

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Determination of D-Ribose and Glucose by High Performance Liquid Chromatography Detection

CUI Feng-jie1，HU Wan-jun1，ZHOU Jue1，SUN Wen-jing1，WEI Zhuan2，XU Qin-hua3，LIU Chang-feng3
（1.School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，Jiangsu，China；2.Hebei Chemical and Pharmaceutical College，Shijiazhuang 050026，Hebei，China；3.Shandong Depu Chemical Technology Co.，Ltd.，Tai'an 271200，Shandong，China）

A rapid HPLC method for simultaneously and quantitatively determining the D-ribose and glucose with RID-detector was established as：Shodex Suger SH1011 column，0.005 mol/L of diluted sulfuric acid solution as the mobile phase，column temperature of 50 ℃ and the injection volume was 10 μL.Retention time of glucose and D-ribose was 11.573 min and 13.313 min，respectively.The regression equations of glucose and D-ribose were Y=6.868 4X-0.069 1 and Y=6.556 5X+0.004 6，respectively，in which Y means concentration of glucose/D-ribose and X means the peak area ratio.Within the linear range of 2 g/L-45 g/L，the precision，stability and reproducibility of the established method was good.The average coefficient of recovery of glucose and D-ribose were 99.27%and 99.61%，RSD were 0.38%and 0.14%respectively，which revealed that the method was accurate and credible.

D-ribose；high performance liquid chromatography（HPLC）；determination of saccharide

2016-10-09

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.14.031

山東省泰安市科技發展計劃項目（201340629）；江蘇大學“青年骨干教師培養工程”青年學術帶頭人培育計劃項目；江蘇大學高級專業人才科研啟動基金項目（08JDG029）

崔鳳杰（1980—），男（漢），教授，博士研究生，研究方向：食品生物技術。