苦蕎蛋白酶解產物的抗氧化活性研究

陳花，張海悅，王鵬

（長春工業大學化學與生命科學院，吉林長春130012）

苦蕎蛋白酶解產物的抗氧化活性研究

陳花，張海悅*，王鵬

（長春工業大學化學與生命科學院，吉林長春130012）

以苦蕎麥為原料，通過堿提酸沉法提取蛋白質復合物，并利用單因素試驗和響應面軟件優化最佳蛋白質提取工藝，優化結果為提取時間50 min，料液比1∶12（g/mL），提取溫度55℃，pH 10.0。正己烷去除苦蕎麥蛋白質復合物中的黃酮類化合物和脂類。堿性蛋白酶酶解苦蕎麥蛋白制備酶解液，研究不同水解度的酶解液的總抗氧化能力，超氧陰離子自由基、羥自由基、DPPH自由基的清除能力，結果表明不同水解度的苦蕎蛋白酶解液都具有抗氧化能力。但具有不同的自由基清除活力，其中超氧陰離子自由基的清除活性最大，其次是DPPH自由基清除活性，幾乎不具有羥自由基清除活性。

苦蕎麥蛋白；響應面軟件分析；蛋白酶解產物；抗氧化能力

苦蕎麥屬于蓼科雙子葉植物，含有多種活性成分，具有抗氧化、降血壓等作用。目前國內外對苦蕎麥的研究大多集中于黃酮類化合物，對蛋白質的研究極少，而苦蕎麥中蛋白質的含量特別豐富（13.45%），是黃酮類化合物（3.25%）的4倍[1]，且苦蕎麥蛋白質氨基酸組成均衡，富含賴氨酸、苯丙氨酸等多種人體必需的氨基酸，是一種生物效價很高的蛋白質。

近年國內外科研人員不斷發現，經蛋白酶水解后的苦蕎蛋白酶解產物，能降血壓、肝臟膽固醇，抑制體內脂肪蓄積，促進排泄、改善便秘，抑制腫瘤、延緩衰老，抑制有害物的吸收等作用[2]。

本文在提高提取率的基礎上優化苦蕎麥蛋白的提取工藝，探討其不同水解度的酶解產物的總抗氧化能力以及對超氧陰離子自由基、羥自由基、DPPH自由基的清除能力。為苦蕎麥及苦蕎麥蛋白的進一步開發研究做基礎。

1 材料與設備

1.1 原材料與試劑

苦蕎麥：吉林省松原市北顯糧油貿易發展有限公司；堿性蛋白酶：南寧龐博生物工程有限公司?？捡R斯亮藍：金泰化玻生物工程公司；總抗氧化能力（T-）試劑盒：上海陽光試劑公司。其他試劑均為分析純。

1.2 設備

電子天平（AL204）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；分光光度計（UV75）：上海佑科儀器儀表有限公司；冷凍干燥機：北京博醫康實驗儀器有限公司。

2 方法

2.1 蛋白質含量測定

參考GB 5009.5-2010《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》[3]中的分光光度法測測定原料苦蕎麥中的蛋白質含量。根據王孝平等[4]考馬斯亮藍法測蛋白質含量的研究方法，并稍作改進，建立了快速測提取液中蛋白質含量的方法。

2.2 苦蕎麥蛋白質提取

首先將苦蕎麥原料粉碎，然后選擇合適的料液比、提取時間、提取溫度、pH值等提取條件進行苦蕎麥蛋白提取，過濾，離心除去雜質得到上清液，調節上清液的pH值至苦蕎麥蛋白的等電點，多次沉淀，離心得到得沉淀苦蕎麥蛋白復合物（BWEP）。

2.3 去除脂類、黃酮類化合物

將上述得到的的蛋白質復合物（BWEP）用正己烷萃取3次，離心得到苦蕎麥蛋白質[5]。

2.4 試驗設計

在提取過程中，以提取率為指標，采用單因素試驗研究料液比、提取時間、提取溫度、pH值對苦蕎麥蛋白質提取的影響，并在此研究的基礎上利用響應面軟件對提取條件進行優化，試驗設計因素，水平及實驗結果記錄如表1。

表1 響應面試驗設計和結果Table 1 The experimental scheme and result table

續表1 響應面試驗設計和結果Continue table 1 The experimental scheme and result table

2.5 苦蕎麥蛋白質（BWP）酶解[6]

稱取一定量苦蕎麥蛋白質，使底物濃度為3%，充分溶解后取母液10 mL備用，調節蛋白質溶解液溫度為 35℃，pH9.0，加入堿性蛋白酶 2 000 U，酶解 3 h，每隔30分鐘取一次酶解液備用于后續研究。

2.6 水解度測定

蛋白質水解度（DH）代表蛋白質在水解過程中，肽鍵被裂解的程度或百分比，計算公式為DH=h/htot。常用的測定方法有pHstate法、茚三酮比色法、硝基苯磺酸法等。本文參考徐英操等[7]蛋白質水解度測定方法中的茚三酮比色法，并在此基礎上稍作改進。

2.7 不同水解度酶解液抗氧化能力測定

2.7.1 總抗氧化能力測定

按照總抗氧化能力試劑盒試劑盒說明書操作。

2.7.2 超氧陰離子自由基清除能力測定

采用鄰苯三酚自氧化法對不同水解度的苦蕎蛋白酶解液的超氧陰離子自由基清除能力進行測定。在比色中加入1 mL濃度為5 mg/mL的不同水解度的苦蕎蛋白水解液，再加入1.5 mL Tris-HCl緩沖液，0.5 mL鄰苯三酚溶液，迅速混合，開始計時，每隔30s讀數一次，至300 s時為止?？瞻讓φ找褐屑尤? mL Tris-HCl緩沖液代替待測樣品溶液。以蒸餾水為參照液，在325 nm條件下測吸光度。計算公式為：

2.7.3 羥自由基清除能力測定

參照李志英等[8]的研究方法，并在此基礎上稍作改進。在試管中加入2 mL 9.0 mmol/L硫酸亞鐵銨和2 mL 9.0 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液，然后分別加入濃度為5 mg/mL的不同水解度的苦蕎蛋白水解液2 mL，最后加入2 mL 8.8 mmol/L過氧化氫啟動反應?？瞻讓φ找褐屑尤? mL蒸餾水代替同體積的苦蕎蛋白水解液，在37℃條件下保溫0.5 h后，以蒸餾水為參照液，在510 nm波長處測定吸光度。計算公式：清除率/%=（A0-AS）/A0×100，式中：A0為空白試樣吸光度值；AS為待測試樣吸光度值。

2.7.4 DPPH自由基清除能力測定

參照Se-Kwon[9]等、Suda[10]等關于DPPH自由基清除率的研究方法，并在此基礎上稍作改進。在試管中加入1.5 mL含0.1 mmoL/L DPPH的95%乙醇，1 mL不同水解度的苦蕎麥蛋白酶解液，混合振蕩，在室溫下放置30 min，然后在波長517 nm處測定吸光度。以1.5 mL 95%乙醇加入1 mL蒸餾水調零做空白對照。計算公式為：

式中：Ac為1.5 mL DPPH溶液加入1.5 mL蒸餾水在517 nm處吸光值；Ai為1 mL樣品液加入1.5 mL DPPH在517 nm處吸光值；Aj為1.5 mL樣品液加入1.5 mL 95%乙醇在517 nm處吸光值。

3 結果與討論

3.1 原材料中的蛋白質含量測定

根據蛋白質含量的測定方法操作。原材料經試樣消解，最終測得原材料中的蛋白質含量為13.04%。

3.2 黃酮化合物去除效果

正己烷萃取苦蕎麥蛋白復合物3次后，用Mg-HCl法檢測黃酮類化合物，結果顯示，反應液不呈現粉紅色，說明苦蕎麥蛋白中不含黃酮類化合物，或含量甚微不足以影響實驗研究。

3.3 料液比、提取時間、提取溫度、pH值對苦蕎麥蛋白質提取率的影響

表1中記錄的試驗數據運用響應面進行分析可知，在各因素所選的實驗條件下，變量之間的相互關系可用以下統計學模型表示：

式中：Y為提取率，%；A為提取時間，h；B為提取溫度，℃；C為pH值；D為料液比，g/mL。

表2分析了該模型的可信度，包括失擬項、信噪比、殘差、P值、F值等。模型的P值是顯著的（P＜0.01），“失擬項”值是不顯著的（P＞0.05），F 值為 4.56，且Prob＞F值為0.38%，說明該模型是顯著的，僅有0.38%的幾率模型會受到外界環境的干擾，這些指標都指示提取率設計的實驗模型具有很好的可信度。R2為0.820 2，意味著模型優化值與實驗真實值之間具有很好的擬合度，可采納。

圖1（a-f）顯示了各因素之間的交互作用，單因素B，C，及交互項AB、AD、BD，B2是顯著的，對苦蕎麥蛋白質提取率具有正增加效應。其中溫度具有最顯著的影響效果，它的變化會比其他因素更強的影響蛋白質提取率。因此我們將蛋白質提取的最佳提取條件優化為提取時間 50 min，料液比 1 ∶12（g/mL），提取溫度55℃，pH 10.0。在該條件下提取的BWEP中蛋白質的含量為85%。

圖1 因素交互作用圖Fig.1 Impact factor intercrossing figure

3.4 水解度測定結果

圖2是以預測組分的標準品甘氨酸含量為橫坐標，該物質在570 nm處的吸光度為縱坐標繪制的標準曲線，該曲線反映了了-NH2含量與吸光度值之間的關系，曲線R2為0.998 2，模型顯著，說明兩者之間具有很好的線性擬合關系，可以用作水解液水解度的測定。

圖2 水解度標準曲線Fig.2 Standard curve of DH

圖3是通過標準曲線和數學表達式計算的不同時間段各酶解液的水解度，圖3顯示，隨著時間的延長，-NH2不斷被酶水解下來，水解度不斷變大。但剛開始水解度增加的速度比較快，逐漸減慢，這是由于隨著時間的推移，底物逐漸完全與酶結合，達到飽和狀態而逐漸趨于平穩。

圖3 不同時間段水解度測定Fig.3 DH of different time

3.5 不同水解度酶解液的抗氧化能力測定

3.5.1 總抗氧化能力測定

圖4是利用總抗氧化能力試劑盒計算的各不同水解時間段下酶解液的總抗氧化能力，結果顯示不同水解度的酶解液都具有抗氧化能力，但水解度與抗氧化能力不成正相關。在60 min和90 min時具有較高的總抗氧化能力。這可能是由于水解液中不同分子量組分的組成不同導致的，而在這兩個時間段的水解液中具有更多的抗氧化活性強的組成成分，我們將在后續研究中進一步純化，分析抗氧化能力強的酶解液的組成成分，分子量大小等。

圖4 總抗氧化能力Fig.4 Total antioxidant

3.5.2 超氧陰離子自由基清除能力

圖5（a）是采用鄰苯三酚法測得的不同水解度條件下各酶解液的超氧陰離子清除能力，結果顯示不同酶解液均具有很高的超氧陰離子清除能力，可以進一步分離純化篩選作為天然抗氧化劑，應用于易產生超氧陰離子的食品中。

3.5.3 羥自由基清除率

圖5 自由基清除率Fig.5 Free radical scavenging rate

圖5（c）是不同水解度條件下各酶解液的·OH清除能力，結果顯示各酶解液幾乎不具·OH清除能力，這可能與測試用酶解液的濃度有關，也可能苦蕎蛋白酶解液幾乎不具有針對羥自由基的清除能力，有待于后續研究。

3.5.4 DPPH自由基清除能力

圖5（b）是不同水解度條件下各酶解液的DPPH·清除能力，結果顯示不同水解度的酶解液均具有DPPH自由基清除能力，但120 min時，酶解液具有很高的清除活性，這與水解液中的生物活性成分有關，具有很多的能與自由基配對的單電子，從而表現出很高的生物活性。

4 結論

苦蕎麥原料中的蛋白質含量為13.04%，通過堿提酸沉法提取的蛋白質粗提物中的蛋白質含量為85%。響應面軟件優化的提取蛋白質的最大提取工藝為：提取時間50 min，提取溫度55℃，pH為10.0，料液比為1∶12（g/mL）?？嗍w麥生物活性肽具有很強的總抗氧化能力和很好的超氧陰離子、DPPH自由基清除能力。我們將在后續研究中對抗氧化能力強的水解液進行分離純化獲得一定分子量大小的高活性生物活性肽，或針對某一自由基清除能力高的酶解液分離純化應用于天然抗氧化劑，并繼續探討苦蕎麥生物活性肽的其他功能，如降血壓、抗疲勞、降血脂等。

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Antioxidant Activity of Fagopyrum tataricum Enzymolysis Product

CHEN Hua，ZHAN Hai-yue*，WANG Peng
（College of Chemistry and Life Science，Changchun University of Technology，Changchun 130012，Jilin，China）

Fagopyrum tataricum was used as raw material，then using alkali extraction and acid precipitation method to extract protein complex，using the single factor experiment and response surface software to optimize the best protein extraction technology，the optimization results was extracting time 50 min，olid-liquid ratio 1∶12（g/mL），extraction temperature 55℃，pH 10.0.Removed the flavonoids and lipids in tartary buckwheat protein by n-hexane.Then，hydrolyzed tartary buckwheat protein into polypeptide solution by alkaline protease.So we can research on the total antioxidant capacity，superoxide anion radical，hydroxyl free radical and DPPH radical scavenging activity of enzymatic hydrolysate with different degree of hydrolysis.The result showed that the enzymatic hydrolysates above，all had antioxidant ability.But they had the different radical scavenging activity，the best was followed by DPPH·and nearly had no·OH scavenging activity.

Fagopyrum tataricum protein；response surface analysis；enzymolysis product；antioxidant activity

2017-05-30

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.14.004

陳花（1989—），女（漢），研究生，碩士，研究方向：天然產物提取。

*通信作者