吸入麻醉藥后處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷影響的比較*

朱家軍，王大亮，王永萬，徐海龍，劉金東△

(1.灌云縣人民醫(yī)院麻醉科，江蘇連云港 222200；2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，江蘇徐州 221002)

吸入麻醉藥后處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷影響的比較*

朱家軍1，王大亮2，王永萬1，徐海龍1，劉金東2△

(1.灌云縣人民醫(yī)院麻醉科，江蘇連云港 222200；2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，江蘇徐州 221002)

目的 探討七氟醚和異氟醚后處理在成年大鼠心肌缺血再灌注損傷(MIRI)中的心肌保護(hù)作用。方法 將成年雄性SD大鼠24只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組(C組)、缺血再灌注組(R組)、七氟醚后處理組(S組)和異氟醚后處理組(I組)，每組6只。建立Langendorff離體心臟灌注模型。于平衡灌注末及再灌注30、90 min時(shí)記錄心率(HR)、左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室發(fā)展壓(LVDP)、左心室壓力上升最大速率(LV+dp/dtmax)和左心室壓力下降最大速率(LV-dp/dtmax)；灌注結(jié)束后，取心尖部心肌組織1 mm3，電鏡下觀察線粒體結(jié)構(gòu)并評(píng)分，剩余心臟組織采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法測(cè)定心肌梗死面積(MIS)。結(jié)果 與R組比較，S組和I組心肌再灌注后的心功能指標(biāo)改善，MIS減小，線粒體損傷減輕(P<0.05)；與S組比較，I組心肌再灌注后的心功能變差，MIS增大，線粒體損傷程度加重(P<0.05)。結(jié)論 七氟醚和異氟醚后處理在成年大鼠MIRI中均有保護(hù)作用，但七氟醚后處理的心肌保護(hù)作用優(yōu)于異氟醚后處理。

心肌缺血；再灌注損傷；七氟醚后處理；異氟醚后處理；線粒體

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人口出現(xiàn)老齡化，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、心肌梗死等缺血性心臟病的發(fā)病率逐漸升高。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)、急性心肌梗死溶栓術(shù)、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)等在缺血性心血管疾病的治療中已廣泛應(yīng)用，隨之發(fā)生的缺血再灌注損傷(IRI)引起醫(yī)學(xué)界的關(guān)注[1]。 七氟醚、異氟醚是目前臨床上常用的吸入麻醉藥，在心肌再灌注之前七氟烷或者異氟烷可以減輕IRI[2-3]，而二者后處理在減輕心肌IRI(MIRI)的作用方面少見報(bào)道。本研究擬采用離體實(shí)驗(yàn)，比較七氟醚和異氟醚后處理在大鼠MIRI中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物來源與分組 成年雄性SD 大鼠24只，220～260 g，由濟(jì)寧市魯康動(dòng)物飼料經(jīng)銷中心提供。用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為4組，對(duì)照組(C組)、缺血再灌注組(R組)、七氟醚后處理組(S組)和異氟醚后處理組(I組)，每組6只。

1.1.2 藥品、試劑和儀器設(shè)備 七氟醚(批號(hào):16020331，上海恒瑞醫(yī)藥有限公司)，異氟醚(批號(hào)：217151201，深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；七氟醚揮發(fā)罐(ANBON libs200)異氟醚揮發(fā)罐(Drager)，K-H 液(mmol/L:NaCl 8,KCl 4.7，KH2PO41.2，MgSO41.2,CaCl22.5，NaHCO325，葡萄糖11.1，EDTA-2Na 0.125)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC，Sigma公司，美國(guó))。壓力傳感器(成都泰盟科技有限公司)；H-600透射式電子顯微鏡(日本日立公司)；LK&V超薄切片機(jī)(瑞典LKB公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠離體心臟缺血再灌注模型制作 參照文獻(xiàn)[4]建立Langendorff大鼠離體心臟灌注模型。3%戊巴比妥30 mg/kg行大鼠腹腔注射麻醉，同時(shí)注射500 IU/mL肝素抗凝，快速打開大鼠胸腔取出心臟，將心臟置入預(yù)充氧的冷(0 ℃)K-H液中，去除主動(dòng)脈根部多余組織，分離出主動(dòng)脈，經(jīng)主動(dòng)脈逆行插管將心臟懸掛于Langendorff灌注裝置上，以K-H液恒壓灌注，將K-H 液用95%O2+5%CO2混合氣體飽，同時(shí)使其溫度和pH 值分別維持在(37.00±0.50)℃和7.40±0.05。C組連續(xù)灌注K-H液130 min；R組平衡灌注K-H液10 min后全心缺血30 min，K-H液再灌注90 min；S組平衡灌注10 min后全心缺血30 min，再用2.50%七氟醚預(yù)充的K-H液灌注15 min，隨后K-H液再灌注75 min。I組平衡灌注10 min后全心缺血30min，再用1.50%異氟醚預(yù)充的K-H液灌注15 min后，再用K-H液再灌注75 min。

1.2.2 血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定 自制直徑約3 mm的乳膠球囊，將其與壓力傳感器相連，隨后將球囊經(jīng)心臟左心耳處剪開的小口置入左心室腔內(nèi)，向球囊內(nèi)注射生理鹽水，使得平衡灌注期左心室舒張末壓(LVEDP)維持在0～10 mm Hg。傳感器經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換器連接計(jì)算機(jī)，連續(xù)監(jiān)測(cè)心率(HR)、LVEDP、左心室發(fā)展壓(LVDP)、左心室壓力上升最大速率(LV+dp/dtmax)和左心室壓力下降最大速率(LV-dp/dtmax)，并于平衡灌注末(T1)及再灌注30 min(T2)和90 min(T3)時(shí)記錄相關(guān)指標(biāo)。

1.2.3 心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察 在再灌注結(jié)束后，切取心尖部組織1 mm3(剩余心肌置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，經(jīng)下列程序處理：戊二醛-四氧化鋨固定液雙固定、乙醇梯度脫水、環(huán)氧丙烷置換、環(huán)氧樹脂浸透、包埋，做成1～2 pm半超薄切片，用亞甲藍(lán)染色后光學(xué)顯微鏡下定位；超薄切片機(jī)制作50～70 nm超薄切片，經(jīng)醋酸鈾、檸檬酸鉛染色后，透射式電子顯微鏡下觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)，進(jìn)行Flameng評(píng)分。評(píng)分方法：每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)挑選5個(gè)視野，每個(gè)視野隨機(jī)選4個(gè)線粒體(線粒體觀察總數(shù)為20)進(jìn)行損傷程度分級(jí)。 0級(jí)：線粒體無明顯腫脹，超微結(jié)構(gòu)正常，基質(zhì)顆粒完好；1級(jí)：線粒體輕度腫脹，結(jié)構(gòu)基本正常，線粒體嵴和基質(zhì)超微結(jié)構(gòu)正常，基質(zhì)顆粒缺失；2級(jí)：線粒體中度腫脹，基質(zhì)顆粒喪失，基質(zhì)透明，線粒體嵴沒有破壞；3級(jí)：線粒體嚴(yán)重腫脹，基質(zhì)顆粒喪失，基質(zhì)均勻透明，線粒體嵴斷裂；4級(jí)：線粒體嚴(yán)重腫脹，基質(zhì)顆粒喪失，線粒體嵴完全斷裂，線粒體膜完整性喪失；從0～4級(jí)分別計(jì)0～4分。

1.2.4 心肌梗死面積測(cè)定 采用TTC染色測(cè)定心肌梗死面積。取冰箱中備用冰凍心肌標(biāo)本，沿著垂直于心臟長(zhǎng)軸的方向?qū)⑿呐K切為2 mm薄片4～6片，放入1%TTC磷酸鹽緩沖液中(pH=7.40)，37 ℃水浴箱中閉光孵育10 min，存活心肌呈正常磚紅色，梗死心肌呈灰白色。染色對(duì)比明顯后留取圖片。Image-J軟件計(jì)算心肌梗死面積(MIS)，計(jì)算公式如下：

MIS=(MIS之和/總面積之和)×100%。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)比較 與C組比較，R、S、I組在T2、T3時(shí)HR、LVDP、LV+dp/dtmax和LV-dp/dtmax降低(P<0.05)，LVEDP升高(P<0.05)；與R組比較，S、I組在T2、T3時(shí)HR、LVDP、LV+dp/dtmax和LV-dp/dtmax均升高(P<0.05)，LVEDP均降低(P<0.05)；與S組比較，I組T2、T3時(shí)HR、LVDP、LV+dp/dtmax和LV-dp/dtmax降低(P<0.05)，LVEDP升高(P<0.05)，見表1、2。

2.2 各組大鼠MIS和線粒體超微結(jié)構(gòu)Flameng評(píng)分比較 與C組比較，R、S、I組MIS增加(P<0.05)；與R比較，S、I組MIS減少(P<0.05)；與S組比較，I組MIS增加(P<0.05)。各組大鼠電鏡心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)顯示，電鏡下見C組線粒體無明顯腫脹、破裂(圖1A)，而R組線粒體明顯腫脹、破裂(圖1B)，S、I組線粒體僅部分腫脹、破裂(圖1C、D)，較R組有明顯改善。與C組比較，R、S、I組線粒體損傷加重(P<0.05)；與R組比較，S、I組線粒體損傷減輕(P<0.05)； 與S組比較，I組線粒體損傷程度增加(P<0.05)。4組大鼠MIS和Flameng評(píng)分比較，見表3。

表1 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)HR、LVEDP及LVDP水平比較

a：P<0.05，與C組比較；b：P<0.05，與R組比較；c：P<0.05，與S組比較。

表2 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)LV-dp/dtmax及LV+dp/dtmax比較

續(xù)表2 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)LV-dp/dtmax及LV+dp/dtmax比較

a：P<0.05，與C組比較；b：P<0.05，與R組比較；c：P<0.05，與S組比較。

表3 各組大鼠MIS和Flameng評(píng)分比較

a：P<0.05，與C組比較；b：P<0.05，與R組比較；c：P<0.05，與S組比較。

A：C組；B：R組；C：S組；D：I組。

圖1 各組大鼠電鏡心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)改變

3 討 論

機(jī)體組織缺血性后，可以通過手術(shù)、溶栓等醫(yī)學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)缺血組織器官重新獲血液灌注，稱缺血再灌注，其結(jié)果使組織器官功能得以改善，但如果組織缺血時(shí)間較長(zhǎng)，在再灌注同時(shí)還會(huì)帶來損傷加重，導(dǎo)致組織IRI。目前，對(duì)IRI的機(jī)制尚不完全清楚，研究表明，自由基、鈣超載及鈣震蕩、細(xì)胞內(nèi)pH和滲透壓等可能是其產(chǎn)生機(jī)制[5]。縮短缺血時(shí)間、亞低溫措施[6]及使用藥物可以減輕此類損傷[7]。

本實(shí)驗(yàn)采用Langendorff離體心臟灌注模型，其優(yōu)點(diǎn)是可以排除神經(jīng)、內(nèi)分泌等因素對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生的影響，較為客觀地評(píng)價(jià)處理因素對(duì)研究結(jié)果的影響。本實(shí)驗(yàn)選擇濃度為2.50%的七氟醚和1.50%的異氟醚是因?yàn)橄喈?dāng)于大鼠1.0最低肺泡有效濃度(MAC)[7-8]，MAC可反映全身麻醉藥物的效價(jià)強(qiáng)度，也是探討麻醉作用機(jī)制的手段之一。因此，本實(shí)驗(yàn)將七氟醚和異氟醚的濃度均控制為1.0MAC。結(jié)果表明，七氟醚后處理和異氟醚后處理都可以改善再灌注后的心功能，減小MIS，發(fā)揮保護(hù)作用，且七氟醚后處理心肌保護(hù)作用優(yōu)于異氟醚后處理。

線粒體是能量生成的重要場(chǎng)所，缺血再灌注時(shí)線粒體極易受到破壞，線粒體在缺血再灌注過程中起著中樞作用[9]。七氟醚和異氟醚的心肌保護(hù)機(jī)制可以通過影響線粒體ATP敏感性鉀離子通道[10-11]和線粒體通透性轉(zhuǎn)化孔開放發(fā)揮改善線粒體功能狀態(tài)的作用[12-13]。此外，線粒體功能障礙，導(dǎo)致細(xì)胞色素C通過線粒體外膜釋放到細(xì)胞質(zhì)中，通過激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，直接啟動(dòng)凋亡途徑，引起細(xì)胞凋亡[14]。七氟醚后處理通過抑制線粒體細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)，下調(diào)Caspase-8蛋白的表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用[15]。七氟醚和異氟醚同屬鹵代烴基醚[5]，七氟醚血?dú)夥峙湎禂?shù)為0.65，異氟醚血?dú)夥峙湎禂?shù)為1.4，在臨床麻醉中，七氟醚在起效時(shí)間、作用強(qiáng)度、清醒時(shí)間等優(yōu)于異氟醚。比較組織/血?dú)夥峙湎禂?shù)七氟醚同樣小于異氟醚[5]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，七氟醚后處理和異氟醚后處理都可以減輕再灌注后線粒體損傷程度，七氟醚后處理的心肌線粒體損傷程度要小于異氟醚后處理，可能與此藥理作用有關(guān)。

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Comparison of effects of post-treatment with inhalation anesthetics on rat myocardial ischemia reperfusion injury*

ZhuJiajun1,WangDaliang2,WangYongwan1,XuHailong1,LiuJindong2△

(1.DepartmentofAnesthesiology,GuanyunCountyPeople′sHospital,Lianyungang,Jiangsu222200,China; 2.DepartmentofAnesthesiology,AffiliatedHospitalofXuzhouMedicalUniversity,Xuzhou,Jiangsu221002,China)

Objective To compare the myocardial protective effects of post-treatment with sevoflurane and isoflurane on myocardial ischemia-reperfusion injury(MIRI) in adult rats.Methods Twenty-four adult male SD rats were divided into four groups(n=6) by using the random number table,control group(C),ischemia-reperfusion group(R),sevoflurane post-treatment(S) and isoflurane post-treatment group(I).The Langendorff isolated heart perfusion model was established.The heart rate(HR),left ventricular end-diastolic pressure(LLVEDP),left ventricular developed pressure(LVDP),maximum rate of rise of left ventricular pressure(LV+dp/dtmax),and maximum rate of decrease of left ventricular pressure(LV-dp/dtmax) were recorded at the end of equilibrium perfusion,and at 30,90 min of reperfusion,respectively.At the end of infusion,1 mm3of apical myocardial tissue was removed for observing mitochondrial structure under electron microscopy and scoring.The myocardial infarct size(MIS) in the remaining heart tissue was measured by TTC staining.Results Compared with the R group,the S and I groups showed improved cardiac function indicators,decreased MIS,and reduced mitochondrial damage after reperfusion(P<0.05).Compared with the S group,the I group showed worse heart function,increased MIS,and more severe mitochondrial damage after reperfusion(P<0.05).Conclusion Post-treatment with sevoflurane and isoflurane has a protective effect on MIRI in adult rats.Post-treatment with sevoflurane has a better cardioprotective effect than that with isoflurane.

myocardial ischemia;reperfusion injury;sevoflurane post-treatment;isoflurane post-treatment;mitochondria

0.3969/j.issn.1671-8348.2017.18.007

2014年連云港市第五期“521工程”科研項(xiàng)目資助計(jì)劃(62)。 作者簡(jiǎn)介：朱家軍(1964-)，主任醫(yī)師，碩士研究生，主要從事麻醉中重要臟器功能保護(hù)研究。△

，E-mail:liujindong1818@163.com。

R453.9

A

1671-8348(2017)18-2468-03

2017-01-22

2017-03-26)