膜性腎病患者腎組織M型磷脂酶A2受體1抗原及其抗體的表達(dá)差異*

洪國保，趙學(xué)峰，吳曉嬋，陳健智，羅福漳△

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬南海醫(yī)院：1.腎內(nèi)科；2.檢驗科；3.病理科，廣東佛山 528200)

膜性腎病患者腎組織M型磷脂酶A2受體1抗原及其抗體的表達(dá)差異*

洪國保1，趙學(xué)峰2，吳曉嬋1，陳健智3，羅福漳1△

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬南海醫(yī)院：1.腎內(nèi)科；2.檢驗科；3.病理科，廣東佛山 528200)

目的 探討腎組織M型磷脂酶A2受體1(PLA2R1)抗原及其抗體在膜性腎病(MN)患者中的表達(dá)水平。方法 選取經(jīng)腎活檢證實的特發(fā)性MN(IMN)58例、乙型肝炎病毒相關(guān)性MN(HBV-MN)15例、V型狼瘡性腎炎(V-LN)17例。采用間接免疫熒光法檢測腎組織PLA2R1抗原，并與IgG4共定位。同時檢測上述MN患者血清抗PLA2R1抗體。分析腎組織PLA2R1抗原及其抗體在MN中的表達(dá)差異，以及PLA2R1陽性與陰性患者臨床資料的差異。結(jié)果 V-LN及HBV-MN患者腎組織及血清中均未發(fā)現(xiàn)PLA2R1抗體；在81.03%IMN患者腎組織檢測到PLA2R1抗原，70.69% IMN患者血清中檢測到PLA2R1抗體，PLA2R1抗原與IgG4共定位，均沿腎小球毛細(xì)血管袢呈細(xì)顆粒狀沉積。PLA2R1抗原陽性患者24 h尿蛋白定量高于陰性患者(P<0.05)，并且血清清蛋白低于陰性患者(P<0.05)。結(jié)論 腎組織PLA2R1抗原在IMN的診斷中敏感性及特異性均較高，且表達(dá)與臨床病情嚴(yán)重性明顯相關(guān)。

特發(fā)性膜性腎病；乙型肝炎病毒相關(guān)性膜性腎病；V型狼瘡性腎炎；M型磷脂酶A2受體1

膜性腎病(membranous nephropathy,MN)是引起成人腎病綜合征(nephrotic syndrome,NS)最常見的病因之一，病理以腎小球上皮下免疫復(fù)合物沉積伴基底膜增厚為特點[1-2]。Xu等[3]對我國7萬余例腎活檢資料統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)IgA腎病(IgAN)占腎穿刺總數(shù)的28.1%，MN占23.4%。MN是繼IgAN之后最常見的腎小球腎炎。并且MN是40歲以上人群中最主要的病理類型，推測MN有可能超越IgAN成為我國最主要的腎小球疾病。MN可分為特發(fā)性MN(IMN)和繼發(fā)性MN(SMN)。各國報道IMN比例不同[4-7]，在我國IMN占31.8%。IMN與SMN主要通過詳細(xì)的病史詢問、實驗室檢查和腎活檢病理(包括光鏡、免疫病理及電鏡)以排除繼發(fā)因素。Beck等[8]學(xué)者于2009年發(fā)現(xiàn)M型磷脂酶A2 受體(PLA2R)與IMN的關(guān)系，并提出該抗原為IMN的主要靶抗原，在約70%IMN患者血清中發(fā)現(xiàn)該抗體，并且提出血清中該抗體及腎組織中該抗原可以用于鑒別IMN與SMN。研究表明，MN患者抗PLA2R1抗體與PLA2R1抗原的表達(dá)存在差異，需要在不同地區(qū)、不同種族人中驗證。在SMN中是否有PLA2R1抗原的表達(dá)及該抗原的表達(dá)與臨床指標(biāo)的關(guān)系均未形成定論。本研究擬使用本院腎活檢證實的MN患者90例臨床資料進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年5月至2016年5月在本院經(jīng)腎活檢確診的MN患者90例，其中IMN患者58例，乙型肝炎病毒相關(guān)性MN(HBV-MN)患者15例，V型狼瘡性腎炎(V-LN)患者17例。IMN的診斷是根據(jù)經(jīng)腎活檢病理檢查診斷為MN，通過病史、檢驗排除SMN。本研究所納入的病例均未長期使用免疫抑制劑或(和)激素治療，所有腎穿刺活檢均經(jīng)患者及家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集 (1)腎組織標(biāo)本：B超聲引導(dǎo)下行腎活檢，常規(guī)行光鏡、免疫熒光和電鏡檢查。使用石蠟包埋組織采用間接免疫熒光法檢測IMN、SMN腎組織PLA2R1抗原。(2)收集患者的血清：留取患者治療前空腹靜脈血，置于促凝劑試管中，3 000 r/min離心8 min，分離血清。

1.2.2 腎組織免疫熒光法檢測PLA2R1抗原及IgG4共定位 (1)切片，烤片；(2)脫蠟：二甲苯；(3)復(fù)水：梯度乙醇；(4)抗原修復(fù)：蛋白酶K 37 ℃孵育30 min，PBS沖洗；(5)一抗：兔抗人PLA2R1多克隆抗體(Sigma-Aldrich)，37 ℃孵育1.5 h，PBS沖洗；(6)二抗：鼠抗兔IgG(abcam)，37 ℃孵育1.0 h，PBS沖洗；(7)加IgG4抗體(Dylight405標(biāo)記，Jackson)，37 ℃孵育1.0 h；(8)封片，熒光顯微鏡下觀察，共聚焦顯微鏡下拍攝。

1.2.3 間接免疫法檢測IMN患者血清抗PLA2R1抗體 采用歐盟檢測試劑盒FA1254-1005-50 IgG。(1)樣本準(zhǔn)備： PBST 1∶10稀釋；(2)加樣：加30 μL至反應(yīng)區(qū)；(3)室溫下放置30 min，PBST沖洗載片；(4)加樣：混勻FITC標(biāo)記的二抗，滴加25 μL熒光二抗；(5)避光室溫溫育30 min，PBST沖洗載片；(6)封片熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 觀察指標(biāo) 年齡、性別、血肌酐、血清清蛋白、24 h尿蛋白定量。

2 結(jié) 果

2.1 各組患者一般資料比較 3組患者的年齡、24 h尿蛋白定量、血清清蛋白、血肌酐比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，僅性別比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。

2.2 IMN及SMN患者腎組織PLA2R1抗原陽性率比較 在58例IMN患者中，81.03%(47/58)IMN患者腎組織檢測到PLA2R1抗原 。PLA2R1(綠色，圖1A)與IgG4(藍(lán)色，圖1B)共定位(圖1C)，均沿腎小球毛細(xì)血管袢呈顆粒狀沉積。其中11例IMN患者腎組織中并未發(fā)現(xiàn)PLA2R1的沉積。在SMN(V-LN及HBV-MN)腎組織中均未發(fā)現(xiàn)PLA2R1抗原的沉積，見圖2。

表1 不同病理類型患者的臨床特征比較

2.3 IMN患者腎組織PLA2R1陽性與陰性臨床資料比較 腎組織抗原陽性與陰性患者在年齡、性別、血肌酐方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。PLA2R1抗原陽性患者24 h尿蛋白定量高于陰性患者(P<0.05)，并且陽性患者血清清蛋白低于陰性患者(P<0.05)，見表2。

表2 IMN腎組織PLA2R1陽性與陰性患者臨床資料比較

A：PLA2R1；B：IgG4；C：PLA2R1與IgG4共定位圖片。

圖1 IMN患者腎組織PLA2R1抗原與IgG4免疫熒光陽性圖片(×400)

A：IMN患者；B：HBV-MN患者；C：V-LN患者。

圖2 腎組織PLA2R1抗原免疫熒光陰性圖片(×400)

A：IMN患者抗體陽性；B：IMN患者抗體陰性；C：HBV-MN患者抗體陰性； D：V-LN患者抗體陰性。

圖3 MN患者血清抗PLA2R1抗體間接免疫熒光圖片(×400)

2.4 腎組織PLA2R1抗原與血清抗PLA2R1抗體陽性率比較 收集90例MN患者腎活檢時空腹血清，檢測血清中抗PLA2R1抗體。在HBV-MN及V-LN患者中均未發(fā)現(xiàn)抗PLA2R1抗體，在58例IMN患者中有41例檢測出該抗體，陽性率為70.69%。在58例IMN患者腎組織及血清均發(fā)現(xiàn)PLA2R1者36例；腎組織PLA2R1抗原陰性，并且血清抗PLA2R1抗體陽性者5例；腎組織抗原陽性，血清抗體陰性者11例；兩者均陰性者6例。MN患者血清抗PLA2R1抗體間接免疫熒光圖片，見圖3。

3 討 論

本研究檢測MN患者腎組織PLA2R1抗原及血清抗PLA2R1抗體，結(jié)果提示在IMN患者腎組織及血清中其陽性率分別為81.03%、70.69%。腎組織PLA2R1抗原與IgG4共定位。腎組織PLA2R1抗原陽性者24 h尿蛋白高于陰性者，并且血清清蛋白低于陰性者。此外，在32例SMN(15例HBV-MN及17例V-LN)患者腎組織中均未發(fā)現(xiàn)PLA2R1抗原，并且在這些患者血清中均未發(fā)現(xiàn)該抗體。

Beck等[8]首次提出PLA2R1為IMN的主要靶抗原。此后PLA2R1在IMN患者腎組織及血清中的表達(dá)受到了越來越多的關(guān)注。后續(xù)研究表明不同種族及地區(qū)PLA2R1的表達(dá)陽性率不一致。Debiec等[9]研究表明,PLA2R1抗原及該抗體陽性率分別為74%、57%。Svobodova等[10]研究表明，PLA2R1抗原及該抗體，陽性率分別為69%、65%。Qin等[11]檢測血清抗PLA2R1抗體，陽性率為81.6%。祝爽爽等[12]檢測腎組織PLA2R1抗原陽性率為85.37%。周廣宇等[13]檢測IMN患者血清抗PLA2R1抗體，陽性率為75%。本研究結(jié)果在IMN患者腎組織及血清中其陽性率分別為81.03%、70.69%。本研究提示腎組織PLA2R1抗原敏感性高于血清該抗體敏感性，并且高于國外所報道陽性率。提示國內(nèi)IMN患者PLA2R1介導(dǎo)者較多。

本研究并未在所有IMN患者腎組織中檢測到PLA2R1抗原，分析原因可能為：(1)其他的抗原參與IMN的發(fā)病(如人Ⅰ型血小板域蛋白7A[14])；(2)在腎活檢時患者雖然臨床表現(xiàn)為NS，但是不處于免疫活動期，所以PLA2R1抗原沒有被檢測出[8]；(3)雖然有些患者病理表現(xiàn)為MN，電鏡未見多部位電子致密物沉積、血清學(xué)檢查及臨床資料均未發(fā)現(xiàn)繼發(fā)因素，但不能完全排除SMN的可能。

關(guān)于腎活檢時PLA2R1抗原表達(dá)與臨床資料的關(guān)系仍有爭議。Xun等[15]分析血清抗PLA2R1抗體陽性患者與陰性患者腎活檢時臨床資料，發(fā)現(xiàn)該抗體陽性患者24 h尿蛋白明顯高于陰性患者。Svobodova等[10]研究結(jié)果提示，腎組織該抗原陽性者與陰性者腎活檢時兩組在血肌酐、24 h尿蛋白定量、血清清蛋白水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。周廣宇等[13]結(jié)果提示，IMN患者PLA2R1抗體陽性者24 h尿蛋白定量高于抗體陰性患者。祝爽爽等[12]研究結(jié)果提示，腎組織PLA2R1陽性患者與陰性患者在腎活檢時血肌酐、血清清蛋白、24 h尿蛋白定量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)[13,15]一致，與祝爽爽等[12]研究結(jié)果不同。分析原因可能為祝爽爽等[12]研究中IMN腎組織PLA2R1抗原陰性者病例數(shù)較少僅6例，若其擴(kuò)大樣本可能會得出不一致結(jié)果。本研究結(jié)果提示腎組織PLA2R1抗原陽性者腎活檢時24 h尿蛋白定量高于陰性者，血清清蛋白低于腎組織PLA2R1抗原陰性者。提示腎組織PLA2R1抗原陽性者病情更嚴(yán)重。

PLA2R1是一種相對分子質(zhì)量為180×103的Ⅰ型跨膜糖蛋白，其參與MN的機(jī)制尚未被完全理解[16-17]。PLA2R1抗原參與MN發(fā)病的機(jī)制及該抗原能否用于治療MN，在后續(xù)工作中有必要繼續(xù)研究。

綜上所述，腎組織PLA2R1抗原在診斷IMN的診斷中敏感性及特異性較高，且腎活檢時腎組織PLA2R1抗原表達(dá)與臨床病情嚴(yán)重性明顯相關(guān)。

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醫(yī)學(xué)統(tǒng)計工作的基本內(nèi)容

按工作性質(zhì)及其先后順序，可將醫(yī)學(xué)統(tǒng)計工作分為實驗設(shè)計、收集資料、整理資料、分析資料。實驗設(shè)計是開展某項醫(yī)學(xué)研究工作的關(guān)鍵，包括醫(yī)學(xué)專業(yè)設(shè)計和統(tǒng)計學(xué)設(shè)計，醫(yī)學(xué)專業(yè)設(shè)計的內(nèi)容包括研究對象納入和排除標(biāo)準(zhǔn)、樣本含量、獲取樣本的方法、分組原則、觀察(檢測)指標(biāo)、統(tǒng)計方法等。收集資料的方法包括各種試驗、檢測或調(diào)查，要求資料完整、準(zhǔn)確、及時、有足夠數(shù)量、具有代表性和可比性等。整理資料包括原始資料的檢查與核對、對資料進(jìn)行分組與匯總等。分析資料即對資料進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，包括進(jìn)行統(tǒng)計描述和統(tǒng)計推斷。

Expression difference of renal tissue M-type phospholipase A2 receptor 1 antigen and its antibody in patients with membranous nephropathy*

HongGuobao1,ZhaoXuefeng2,WuXiaochan1,ChenJianzhi3,LuoFuzhang1△

(1.DepartmentofNephrology;2.DepartmentofClinicalLaboratory;3.DepartmentofPathology,AffiliatedNanhaiHospitalofSouthMedicalUniversity,Foshan,Guangdong528200,China)

Objective To detect the expression levels of renal tissue M-type phospholipase A2 receptor 1(PLA2R1) antigen and its antibody in the patients with membranous nephropathy(MN).Methods Fifty-eight cases of biopsy-proved idiopathic membranous nephropathy(IMN),fifteen cases of hepatitis B-associated membranous nephropathy(HBV-MN) and seventeen cases of V type lupus nephritis(V-LN) were selected.Renal tissue PLA2R1 antigen was detected by indirect immunofluorescence and colocaliazed with IgG4.Serum anti-PLA2R1 antibody was simultaneously examined.The expression difference of PLA2R1 antigen and anti-PLA2R1 antibody in MN was analyzed.And the differences of clinical data were analyzed between PLA2R1 positive and negative patients.Results The PLA2R1 antibody was not found in the renal tissue and serum of the patients with LN and HBV-MN;PLA2R1 antigen was found in 81.03% of IMN patients,and its antibody was found in serum of 70.69% of IMN patients.PLA2R1 antigen and IgG4 co-localization all deposited along glomerular capillary loop presenting as fine granules.The 24 h urine protein level in the patients with PLA2R1 antigen deposition in renal tissues was higher than that in the patients without PLA2R1 deposition (P<0.05),moreover serum albumin level was lower than that in the patients without PLA2R1 deposition(P<0.05).Conclusion The sensitivity and specificity of renal tissue PLA2R1 antigen in the diagnosis of IMN are higher.The expression of PLA2R1 antigen in renal tissue by biopsy is significantly correlated with the clinical severity.

idiopathic membranous nephropathy;hepatitis B virus associated membranous nephropathy;V lupus nephritis;M-type phospholipase A2 receptor 1

佛山市衛(wèi)生和計劃生育委員會醫(yī)學(xué)科研課題( 20160213)。作者簡介：洪國保(1982—)，主治醫(yī)師，在讀博士研究生，主要從事腎小球疾病臨床及病理研究。△

，E-mail:luo1844@126.com。

0.3969/j.issn.1671-8348.2017.18.006

R692.3+1

A

1671-8348(2017)18-2461-03

2017-01-17

2017-03-16)