MNES 對腦損傷后昏迷大鼠PFC 去甲腎上腺素α1 受體表達的影響*

陳 琴，杜 青，馮 珍

(南昌大學第一附屬醫院康復醫學科，南昌 330006)

MNES 對腦損傷后昏迷大鼠PFC 去甲腎上腺素α1 受體表達的影響*

陳 琴，杜 青，馮 珍△

(南昌大學第一附屬醫院康復醫學科，南昌 330006)

目的 探討正中神經電刺激(MNES)對腦損傷(TBI)后昏迷大鼠的促醒作用及其對前額葉皮質(PFC)去甲腎上腺素α1受體(α1R)表達的影響。方法 將健康成年SD大鼠72只分為對照組、假刺激組、刺激組和拮抗劑組。對照組不做任何處理，其余3組均制作TBI昏迷大鼠模型，假刺激組不做治療，拮抗劑組大鼠側腦室注射食欲素受體1(OX1R)拮抗劑SB334867，刺激組和拮抗劑組均給予MNES治療。觀察各組大鼠行為學變化，并應用免疫組織化學技術檢測各組大鼠PFC區α1R表達水平。結果 刺激組和拮抗劑組蘇醒大鼠分別為13只和8只，而假刺激組僅有4只蘇醒。α1R水平從低到高依次為對照組、假刺激組、拮抗劑組、刺激組，并呈依次遞增趨勢，且差異有統計學意義(P<0.05)。結論 MNES可改善TBI后昏迷大鼠的意識狀態水平，其機制可能與上調PFC區α1R表達水平有關，且食欲素A參與調節此過程。

正中神經；電刺激療法；腦損傷；昏迷；促醒；受體，腎上腺素能α1；食欲素A

近年來，腦損傷(traumatic brain injury，TBI)增長率(21%)遠超全球人口的增長率(6%),有“靜息性流行病”之稱[1]，已成為全球醫療難題。昏迷是TBI的嚴重并發癥之一。我國因TBI所致的長期昏迷患者以10萬人/年的速度遞增，給國家和患者家庭帶來沉重的負擔[2]。目前臨床上治療TBI昏迷的方法有[3]：藥物治療、物理治療、高壓氧治療、中醫針灸治療等。電刺激治療作為一種物理療法已應用于臨床昏迷患者促醒的治療[4],常用的電刺激方法包括：頸部脊髓硬膜外刺激(cervical spinal cord stimulation，cSCS)、深部腦刺激(deep brain stimulation，DBS)和正中神經電刺激(median nerve electrical stimulation，MNES)等。本課題前期研究了MNES對TBI后昏迷大鼠促醒作用與食欲素A(Orexin-A，OXA)及食欲素1型受體(OX1R)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA) b受體的關系[5-8]。本研究旨在探討MNES對TBI后昏迷大鼠的促醒作用及其對前額葉皮質(PFC)區去甲腎上腺素α1受體(α1R)表達的影響，同時探究α1R與OXA及OX1R之間的關系，證實OXA在TBI昏迷促醒中是否起“開關”作用。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實驗動物：普通級成年SD大鼠72只，體質量250～300 g，由南昌大學醫學部動科部提供。適宜條件下飼養1周后開始實驗。(2)主要試劑與儀器設備：抗α1-腎上腺素受體(α1-adrenergic receptor，α1-AR)兔多克隆抗體購自英國Abcam公司；OX1R受體拮抗劑(SB334867)由美國Tocris bioscience公司提供；ZS-BS數顯腦立體定位儀購自北京眾實迪創科技發展有限公司；其他儀器包括：電刺激儀(ES-420)、切片機(RM2015,Leica Germany)等。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及模型建立 將72只大鼠分為4組，每組18只。對照組：不做任何處理；假刺激組：造模成功的TBI昏迷大鼠；刺激組：造模成功的TBI大鼠給予MNES治療；拮抗劑組：造模成功的TBI大鼠側腦室注射OX1R拮抗劑后給予MNES。使用經典“自由落體撞擊法”構建TBI昏迷大鼠模型。乙醚吸入麻醉，取俯臥位，暴露顱頂，立體定位儀定位：中線左側旁開2 mm、冠狀縫前1 mm，用注射器針頭十字標記此點為撞擊點。待大鼠翻正反射恢復，依據大鼠體質量，將質量400 g圓形鐵柱從38～42 cm高度沿垂直金屬桿自由下落，撞擊顱骨表面撞擊點上的薄鋁墊片，致顱骨凹陷性骨折，操作完畢，消毒并縫合皮膚。1 h后采用雙盲法完成意識狀態等級評分。根據大鼠感覺及運動功能情況，將大鼠意識狀態分6級，Ⅰ級：在籠內活動如常；Ⅱ級：在籠內活動減少；Ⅲ級：在籠內活動減少并運動失調；Ⅳ級：當背部放在籠的底部時能滾動(翻正反射存在)但不能站立；Ⅴ級：翻正反射消失但對疼痛刺激有肢體回縮反應；Ⅵ級：對任何刺激無反應。將Ⅴ、Ⅵ級評定為昏迷狀態納入實驗[9]。實驗過程中大鼠意外死亡共8只：假刺激組5只，刺激組1只，拮抗劑組2只，在MNES治療過程中無大鼠死亡，并重新挑選合格大鼠行相應的處理給予補充。

1.2.2 側腦室注射OX1R拮抗劑 造模成功的TBI大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)進行麻醉。麻醉起效后，將大鼠取俯臥位，固定于腦立體定位儀上，拆去大鼠頭頂部縫合線，暴露顱頂，消毒鋪巾。定位于前囟向后1.0 mm，正中線旁開1.5 mm處，用顱骨鉆于此處鉆孔，切忌誤入腦組織。用微量進樣器抽取SB334867[10 mg/kg粉末溶解于60∶40二甲基亞砜(DMSO)]約5 μL，固定進樣器后垂直進針，顱骨表面往下約4.5 mm，以2.5 μL/min速度泵注，注射完畢留針2～3 min后退針，消毒并縫合頭皮。將大鼠放置于恒溫加熱墊上，觀察行為學反應，1 h后給予MNES治療。

1.2.3 MNES方法 刺激組大鼠在TBI昏迷造模成功后給予MNES治療；拮抗劑組大鼠TBI造模成功后先行側腦室注射OX1R，再給予MNES治療；假刺激組連接MNES儀，但無電流輸出。MNES治療方法：于大鼠右前肢腕部內側正中，距腕橫紋約5 mm處插入1根毫針，齒狀接頭夾住毫針，連接刺激儀。設置刺激參數：頻率30 Hz，脈寬0.5 ms，電流1.0 mA。總治療時間為15 min，共3個循環。刺激結束后1 h，再次評估意識狀態水平，實驗完畢，返回籠中，給予充足的食物和水。

1.2.4 實驗標本提取與免疫組織化學檢測 (1)實驗標本提取：每個時間點每組處理大鼠6只，取腦組織標本6個。于實驗結束后6、12、24 h，腹腔注射10%水合氯醛(0.1 g/mL)深度麻醉大鼠，行正中開胸暴露心臟。將成人頭皮針(針尖磨平)插入左心室至主動脈弓，剪開右心耳，注入加有肝素鈉的滅菌生理鹽水約200 mL，直至流出液變清亮，緩慢灌注4%多聚甲醛約200 mL，直到大鼠整個身體僵硬，斷頭取大腦PFC區。(2)免疫組織化學檢測：將腦組織置于4%的水合氯醛溶液內固定12 h，并在PBS液中冷凍保存。腦組織行冠狀切片，厚度4 μm，PBS漂洗后用0.3%的過氧化氫液處理30 min，滴加正常山羊血清封閉液，室溫條件下孵育1 h，按1∶500比例滴加抗α1R抗體，4 ℃冰箱過夜，PBS洗滌后再滴加生物素標記的山羊抗兔IgG,室溫孵育1 h。最后由有經驗的病理實驗師在顯微鏡下觀察免疫組織化學實驗結果，進行400 倍的顯微照相，最后計算出免疫組織化學評分(immunohistochemical score，IHS)。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0 統計軟件進行分析，不同組別和時間點的α1R水平以秩均值表示，作Kruskal-Wallis H秩和檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠行為學改變比較 MNES治療后1 h再次進行意識狀態評估，刺激組中13只大鼠出現翻正反射(Ⅲ級8只，Ⅳ級5只)；拮抗劑組中8只大鼠出現翻正反射(Ⅲ級4只，Ⅳ級4只)；假刺激組中4 只出現翻正反射(Ⅳ級4只)。

2.2 各組大鼠免疫組織化學檢測 α1R在PFC區神經元細胞膜和細胞質中均有表達(圖1)。組間IHS比較：α1R水平從低到高依次為對照組(31.56)、假刺激組(31.78)、拮抗劑組(33.34)和刺激組(48.67)，兩兩比較差異有統計學意義(P<0.05)。實驗結束后6、12、24 h 3個時間點的α1R的表達水平分別為34.25、35.08、40.17，呈依次遞增趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。

圖1 各組大鼠PFC區α1R水平表達(×400)

3 討 論

MNES作為一種外周神經電刺激治療昏迷的方法，于1996年被日本學者Yokotama首次報道。有研究證實，MNES不僅用于治療持續植物狀態，而且還可用于各種病因所致的意識水平下降的促醒[10-11]。MNES具有非創傷性、無明顯并發癥、易操作且費用低廉等優點[12]，已廣泛應用于臨床昏迷患者的促醒治療。MNES治療昏迷促醒的臨床效果確切，但機制尚未完全明晰。目前認為MNES促醒的可能機制為[10-11,13-15]：激活上行網狀激活系統(ascending reticular activating system，ARAS)和覺醒相關核團；增強腦電活動，改善大腦皮質興奮性；增加大腦皮質血流量灌注，減少神經細胞死亡，促進神經元再生；促進神經營養因子釋放，提高大腦神經可塑性；影響大腦神經遞質的分泌。正中神經的神經元突觸直接參與ARAS活動[13]，ARAS包括3個主要的覺醒系統：膽堿能系統、中縫背核-五羥色胺(5-HT)系統、藍斑-去甲腎上腺素能系統，其中藍斑核(locus coeruleus，LC)合成分泌的去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)廣泛釋放，并支配整個皮質、間腦和大腦的其他區域[16]。而且NE是維持覺醒的重要神經遞質之一，通過其興奮性受體發揮促醒作用。

藍斑-去甲腎上腺素能系統參與調解睡眠-覺醒。LC合成和釋放的NE廣泛分布于中樞神經系統，NE包含α1、α2和β受體家族，在眾多腦區均有表達。NE通過興奮性受體α1作用于大腦皮質，維持大腦皮質電生理活動，維持覺醒狀態[17]。PFC參與調節覺醒、認知、運動、注意及獎賞等功能。有研究表明，激活大鼠PFC區α1R可提高大鼠覺醒水平，從而改善認知能力[18]。此外，Hilakivi等[19]研究發現α1R拮抗劑可以延長貓的睡眠時間，而α1R激動劑縮短其睡眠時間，維持覺醒狀態。因此，推測MNES昏迷促醒作用可能與PFC區α1R表達變化有關。

本實驗通過觀察大鼠行為學變化，發現刺激組昏迷大鼠18只中有13只清醒，拮抗劑組蘇醒8只，假刺激組僅蘇醒4只，表明MNES能提高意識狀態水平，促進覺醒。此外，通過免疫組織化學檢測發現PFC組織中α1R的表達水平呈對照組、假刺激組、拮抗劑組、刺激組依次遞增趨勢，差異有統計學意義(P<0.05)，其中刺激組明顯高于假刺激組，提示MNES可上調α1R表達水平。由此可說明MNES對TBI后昏迷大鼠具有促醒作用，其作用機制可能與增加PFC區α1R表達有關。假刺激組高于對照組，可能與TBI后應激性腦保護作用相關，以適應機體內外環境的變化。本研究組前期研究結果發現，MNES可以通過上調OXA及其受體OX1R的表達水平從而促進昏迷大鼠覺醒，且OXA在此過程中扮演著重要角色[5-7]。但是OXA是否參與調節α1R的表達，尚并不明晰。本研究中拮抗劑組大鼠經側腦室注射OX1R拮抗劑SB334867后給予MNES治療，結果發現：與刺激組相比，拮抗劑組大鼠蘇醒只數少，PFC區α1R表達水平也比較低。由此證實了OX1R及其受體OX1R參與MNES促覺醒過程，其機制可能與OX1R上調PFC區α1R表達有關，但其具體分子機制還需進一步研究。6、12、24 h 3個時間點的α1R的表達水平呈依次遞增趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)，這可能與藍斑-去甲腎上腺素能神經元自身節律相關。當然，本實驗需要進一步完善，如延長觀察時間；檢測其他相關促醒腦區α1R的表達水平。且本實驗研究的是單次治療效果，本課題組將進一步探究MNES的長期療效以及其相關的分子機制。

綜上所述，MNES可以促進TBI后昏迷大鼠意識水平，并上調PFC中α1R表達水平。因此，本研究組推測MNES治療TBI后意識水平的改善可能與增加PFC區α1R表達有關。上調PFC區α1R表達水平可能是MNES昏迷促醒的機制之一，且OXA參與調節此過程，但是具體的分子機制還有待進一步研究。

[1]王波定，王洪財，朱坤燦，等．創傷性腦損傷模型的延續與完善:二次腦損傷模型[J]．中華神經醫學雜志，2013，12(4)：426-429．

[2]陳健．腦外傷長期昏迷患者促醒治療[J]．吉林醫學，2013，34(27)：5740-5742．

[3]Cossu G.Therapeutic options to enhance coma arousal after traumatic brain injury:state of the art of current treatments to improve coma recovery[J].Br J Neurosurg,2014,28(2):187-198.

[4]Lei J,Wang L,Gao G,et al.Right median nerve electrical stimulation for acute traumatic coma patients[J].J Neurotrauma,2015,32(20):1584-1589.

[5]Feng Z,Zhong YJ,Wang L,et al.Resuscitation therapy for traumatic brain injury-induced coma in rats:mechanisms of median nerve electrical stimulation[J].Neural Regeneration Res,2015,10(4):594-598.

[6]Zhong F,Wang W.Wake-promoting actions of median nerve stimulation in TBI-induced coma:an investigation of orexin-A and orexin receptor 1 in the hypothalamic region[J].Mol Med Rep,2015,12(3):4441-4447.

[7]鐘穎君，王亮，魏天琪，等．正中神經電刺激對腦外傷后昏迷大鼠前額葉皮質及下丘腦Orexin-A及其受體OX1R表達變化的影響[J]．中國康復醫學雜志，2015，30(7)：640-644．

[8]魏天祺，馮珍．正中神經電刺激對腦外傷后昏迷大鼠γ-氨基丁酸b受體表達變化的影響[J]．中國康復醫學雜志，2016，31(1)：9-13．

[9]Morgan M,Lockwood A,Steinke D,et al.Pharmacotherapy regimens among patients with posttraumatic stress disorder and mild traumatic brain injury[J].Psychiatr Serv,2012,63(2):182-185.

[10]Liu JT,Lee JK,Tyan YS,et al.Change in cerebral perfusion of patients with coma after treatment with right median nerve stimulation and hyperbaric Oxygen[J].Neuromodulation,2008,11(4):296-301.

[11]黃強，戴偉民，揭園慶，等．重型顱腦損傷昏迷患者持續右正中神經刺激促進復蘇的臨床研究[J]．中國臨床神經科學，2011，19(3)：314-316,320．

[12]楊初燕,王亮,馮珍,等.正中神經電刺激對腦外傷后昏迷患者促醒作用的臨床及機制研究[J].中國康復醫學雜志,2016,31(11):1195-1199.

[13]Cooper EB,Scherder EJ,Cooper JB.Electrical treatment of reduced consciousness:experience with coma and Alzheimer′s disease[J].Neuropsychol Rehabil,2005,15(3/4):389-405.

[14]王士強，麥浩堅，鐘新云，等．右正中神經電刺激對腦損傷術后昏迷患者催醒的臨床研究[J]．熱帶醫學雜志，2015，15(4)：527-529．

[15]王廣斌，謝麗君，吳貴平，等．右正中神經電刺激對重型顱腦損傷患者腦血流灌注影響的 SPECT-CT 觀察[J]．臨床神經外科雜志，2014，11(2)：137-139．

[16]Dailey JW,Yan QS,Adams-Curtis LE,et al.Neurochemical correlates of antiepileptic drugs in the genetically epilepsy-prone rat(GEPR)[J].Life Sci,1996,58(4):259-266.

[17]Samuels ER,Szabadi E.Functional neuroanatomy of the noradrenergic locus coeruleus:its roles in the regulation of arousal and autonomic function part II:physiological and pharmacological manipulations and pathological alterations of locus coeruleus activity in humans[J].Curr Neuropharmacol,2008,6(3):254-285.

[18]Lapiz MS,Morilak DA.Noradrenergic modulation of cognitive function in rat medial prefrontal cortex as measured by attentional set shifting capability[J].Neuroscience,2006,137(3):1039-1049.

[19]Hilakivi I,Leppavuori A.Effects of methoxamine,and alpha-1 adrenoceptor agonist,and prazosin,an alpha-1 antagonist,on the stages of the sleep-waking cycle in the cat [J].Acta Physiol Scand,1984,120(3):363-372.

Effect of median nerve electrical stimulation on expression of α1-adrenergic receptor in prefrontal cortex of coma rats induced by traumatic brain injury*

ChenQin,DuQing,FengZhen△

(DepartmentofRehabilitationMedicine,FirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006,China)

Objective To investigate the wake-promoting action of median nerve electrical stimulation(MNES) in coma rats induced by traumatic brain injury(TBI) and its influence on the expression of α1-adrenergic receptor(α1R) in the prefrontal contex(PFC).Methods Seventy-two healthy Sprague Dawley(SD) rats were randomly divided into the control group,sham-stimulated group(TBI),stimulated group(TBI+MNES) and antagonist group(TBI+OX1R antagonist+MNES).The control group had no any treatment.The TBI coma rat models were prepared in the other 3 groups.The sham stimulated group had no treatment.The antagonist group was injected with orexin receptor-1(OX1R) antagonist SB334867 into lateral ventricle,and both the antagonist group and stimulated group

MNES treatment.Then the behavior changes of rats in each group were observed and the α1R expression level in PFC was detected by using the immunohistochemistry technique.Results Thirteen rats in the stimulated group and 8 rats in the antagonist group revived,while only 4 rats in the TBI group.The α1R levels from low to high were the blank control group,sham-stimulated group,antagonist group and stimulated group,showing the increasing trend,and the difference was statistically significant(P<0.05).Conclusion MNES can improve the rat consciousness level after TBI coma,and its mechanism may be related with up-regulating the α1R expression level in PFC area,moreover Orexin-A participates in this regulation process.

median nerve;electric stimulation therapy;brain injuries;coma;wake-promoting;receptors,adrenergic,alpha-1;Orexin-A

0.3969/j.issn.1671-8348.2017.18.002

國家自然科學基金資助項目(81260295)；江西省自然科學基金資助項目(20132BAB205063)。 作者簡介：陳琴(1990-)，碩士研究生，主要從事神經康復方向研究。△

，E-mail:fengzhenly@sina.com。

R651.1

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1671-8348(2017)18-2453-03

2017-02-02

2017-04-06)