微球法檢測(cè)干眼患者淚液中IFN-γ與IL-17細(xì)胞因子濃度的相關(guān)分析

孟紫薇 崇曉霞（通訊作者）

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院眼科，內(nèi)蒙古呼和浩特010030）

微球法檢測(cè)干眼患者淚液中IFN-γ與IL-17細(xì)胞因子濃度的相關(guān)分析

孟紫薇 崇曉霞（通訊作者）

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院眼科，內(nèi)蒙古呼和浩特010030）

目的通過(guò)微球法（Cytometric bead array，CBA），即微量樣本多重蛋白定量技術(shù)測(cè)定干眼患者與正常對(duì)照組淚液中的兩種細(xì)胞因子IFN-γ（Interferon-γ）與IL-17（Interleukin-17）的濃度，探討炎癥因素在干眼的發(fā)病機(jī)制中的作用。分析各組淚液中IFN-γ與IL-17兩種細(xì)胞因子的濃度與臨床檢查結(jié)果的相關(guān)性。方法本研究為2015年至2016年內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院眼科門(mén)診就診的患者，進(jìn)行包括視力、淚膜破裂時(shí)間（Break up time，BUT）、淚液分泌實(shí)驗(yàn)I（Schirmer I test，SⅠt），依據(jù)日本干眼標(biāo)準(zhǔn)（2005）篩選功能性干眼患者21例（21眼：14例右眼，7例左眼），其中男4人（4眼：2例左眼，2例右眼），女17人（17眼：12例右眼，5例左眼），眼別篩選依據(jù)患者自覺(jué)癥狀較為嚴(yán)重的一側(cè)。依據(jù)正常對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)篩選健康志愿者18例（18眼：11例右眼，7例左眼），其中男4人（4眼：2例左眼，2例右眼），女14人（14眼：9例右眼，5例左眼），眼別選取與病例組性別相匹配（兩組間每側(cè)眼男女比例接近1：1）。使用毛細(xì)管法收集上述兩組淚液。通過(guò)CBA法檢測(cè)淚液樣品中IFN-γ與IL-17的濃度，并與臨床檢查結(jié)果進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果正常組與對(duì)照組的年齡、性別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.558）。兩組被檢者SⅠt有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）；兩組淚液樣本中IL-17濃度與SⅠt有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.38，P=0.001）；被檢者SⅠt結(jié)果與BUT結(jié)果相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。結(jié)論①兩組被檢者淚液中的細(xì)胞因子濃度并未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但病例組IFN-γ濃度中位數(shù)較對(duì)照組高。②兩組被檢者SⅠt結(jié)果與BUT結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明傳統(tǒng)方法檢測(cè)仍是不可代替的檢查方法。且SⅠt與BUT是評(píng)估干眼的敏感指標(biāo)。③被檢者IL-17濃度與SⅠt結(jié)果存在正相關(guān)性，推斷IL-17濃度的增加對(duì)淚液的減少分泌是一種保護(hù)性因素。

干眼；CBA法；IFN-γ；白細(xì)胞介素

干眼是常見(jiàn)眼病，是由于淚液的質(zhì)或量或流體動(dòng)力學(xué)異常引起的淚膜不穩(wěn)定和（或）眼表?yè)p害，從而導(dǎo)致眼不適癥狀及視功能障礙的一類(lèi)疾病[1]。發(fā)病率逐年增高，臨床癥狀多樣，癥狀與臨床檢查結(jié)果的一致性差。有研究表明淚膜滲透壓的升高和炎癥原因都是導(dǎo)致干眼的重要因素[2]，研究淚液中的炎性因子的變化，能夠發(fā)現(xiàn)炎癥因素與干眼相關(guān)性。關(guān)于淚液中的蛋白質(zhì)國(guó)外Zhou等[3]曾報(bào)道了正常人淚液中包含1500多種蛋白。在淚液中占20%左右的四種主要蛋白分別是溶菌酶、乳鐵蛋白、分泌型免疫球蛋白（Secretory immunoglobulin A，SIgA）以及載脂蛋白lipocalin。干眼中致病的免疫細(xì)胞中不斷活化的主要是CD4+T細(xì)胞，Th17作為一種CD4+T細(xì)胞，特異性分泌IL-17家族細(xì)胞因子[4]，IL-17主要是指IL-17A，輔助性T細(xì)胞-17（T helper cell，Th17）是2005年研究自身免疫疾病時(shí)發(fā)現(xiàn)的新型Th亞群，Th17可以產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，包括IL-17、IL-21等，Th17以及它所產(chǎn)生的細(xì)胞因子能夠介導(dǎo)炎癥反應(yīng)從而成為疾病的重要發(fā)病環(huán)節(jié)[5]，并且Th17細(xì)胞抑制作用的喪失可能會(huì)導(dǎo)致干眼。Th17細(xì)胞參與發(fā)病機(jī)制在于眼表干燥環(huán)境導(dǎo)致Th17細(xì)胞誘導(dǎo)因子，如IL-6、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、IL-23等增強(qiáng)表達(dá)，通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)Th17細(xì)胞分化分泌效應(yīng)IL-17。IL-17還參與了中性粒細(xì)胞的增生、成熟和趨化并能夠促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟[6]，IL-17與受體結(jié)合，分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）和炎性因子，導(dǎo)致眼表上皮損傷，加重干眼病情。Li等[7]認(rèn)為IL-12、IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α等細(xì)胞因子均誘導(dǎo)小的富含脯氨酸蛋白1B（SPRR1B），而SPRR1B是眼表上皮鱗狀化生的標(biāo)志。原有研究發(fā)現(xiàn)干燥綜合癥患者的淚腺及涎腺中存在IFN-γ的高表達(dá)[8]。干擾素IFN可分為兩型，IFN-α與IFN-β屬于I型干擾素，主要的功能是消除病毒。IFN-γ屬于II型干擾素，主要功能是介導(dǎo)和調(diào)節(jié)特異性免疫[9]。并且有研究[10-11]證實(shí)過(guò)Th1型細(xì)胞與IL-17之間存在相互調(diào)節(jié)，IL-17可以與IFN-γ共同作用，并且放大其致炎作用。

由于干眼患者淚液較少，所以采用Cytometricbead array（CBA）即微量樣本多重蛋白定量技術(shù)，這是一個(gè)基于流式細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)的多重蛋白定量測(cè)定方法，這種方法靈敏度高，而且可以同時(shí)檢測(cè)多種蛋白，能夠解決樣本量較少的問(wèn)題。它利用不同的捕獲微球包被有特異性的捕獲抗體，與待測(cè)樣品帶有的自身抗原結(jié)合后，加入檢測(cè)抗體，孵育形成“三明治”復(fù)合物，檢測(cè)抗體帶有不同的熒光強(qiáng)度，通過(guò)流式細(xì)胞儀可分析結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象：選取2015至2016年內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院眼科門(mén)診就診的患者進(jìn)行篩查。干眼組：按照納入標(biāo)準(zhǔn)確定功能性干眼患者21例，其中男4人，女17人。及健康志愿者18人，其中男4人，女14人，眼別選取與病例組性別相匹配。所有研究對(duì)象都要進(jìn)行基礎(chǔ)眼部檢查包括視力檢查、眼壓、裂隙燈檢查、直接眼底鏡檢查、SⅠt以及BUT檢查。所有相關(guān)檢查均取得患者同意后進(jìn)行。

1.2 檢查以及收集方法

1.2.1 SⅠt基礎(chǔ)淚液分泌實(shí)驗(yàn)：將測(cè)試淚液專(zhuān)用濾紙一端使用無(wú)菌鑷反折5 mm，輕輕置于患者下瞼結(jié)膜囊中外1/3處，另一端自然下垂，囑受檢者輕輕閉眼，5 min后觀察濾紙被淚液濕潤(rùn)的長(zhǎng)度。

1.2.2 BUT檢查：使用Tomy全自動(dòng)角膜地形圖儀準(zhǔn)確測(cè)量BUT時(shí)間。調(diào)整機(jī)器使用BUT模式，囑患者正常瞬目?jī)纱魏螅褂媒悄さ匦螆D儀測(cè)量被檢者淚膜破裂時(shí)間，三次取平均值。

1.2.3 毛細(xì)管法收集研究對(duì)象淚液：在受試者瞬目數(shù)次后用40 μL毛細(xì)管于患者外眥部收集淚液，在不刺激到患者的情況下收集淚液約5 μL，迅速送往-80℃冰箱保存樣本，待使用。

1.2.4 角膜熒光素染色：評(píng)分方法規(guī)定，無(wú)染色為0分，將角膜平均分為四個(gè)象限，每個(gè)象限又分為輕、中、重度三級(jí)，共為0～12分，規(guī)定＜1分為正常。

2 結(jié)果

2.1 年齡性別對(duì)比：病例組與正常對(duì)照組在年齡（P=0.67）、性別（P=1.00）分布上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2 臨床檢查結(jié)果比較：病例組IL-17A濃度為（3279.80±1584.21）fg/mL，正常組濃度為（4086.46± 1980.14）fg/mL。病例組IFN-γ濃度中位數(shù)為3362.37（1493.62～5732.51）fg/mL，正常對(duì)照組濃度中位數(shù)為3975.20（2552.63～13334.25）fg/mL，兩組IFN-γ和IL-17比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。干眼組患者BUT平均值為（2.18±2.18）s，正常組患者的BUT為（4.85±2.40）s。SⅠt正常組為（18.00±5.86）mm，干眼組為（10.00±7.88）mm。兩組被檢者BUT和SⅠt存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001），詳見(jiàn)表1。

表1 干眼組與正常對(duì)照組臨床檢查結(jié)果

2.3 相關(guān)性分析：淚液樣本中IL-17濃度與SⅠt存在相關(guān)性（P=0.001），淚液樣本中IL-17濃度與BUT結(jié)果沒(méi)有相關(guān)性（P=0.25），IFN-γ濃度BUT結(jié)果無(wú)相關(guān)性（P=0.31）。IFN-γ濃度與臨床檢查SⅠt結(jié)果沒(méi)有相關(guān)性（P=0.484），SⅠt結(jié)果與BUT結(jié)果存在相關(guān)性（P＜0.01），詳見(jiàn)圖1和圖2。

2.4 男女性別IFN-γ和IL-17比較：正常組中男性與女性淚液中IFN-γ（P=0.40）與IL-17（P=0.43）濃度均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，干眼組患者男性與女性淚液中IFN-γ（P=0.53）與IL-17（P=0.38）濃度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖1 受檢者淚液中IL-17濃度與SⅠt相關(guān)性分析

圖2 受檢者BUT檢查及SⅠt檢查結(jié)果相關(guān)性分析

3 討論

1996年美國(guó)國(guó)立眼科研究所干眼研究組將角結(jié)膜干燥癥與干眼癥作為同一概念，稱(chēng)為干眼[12]。所以干眼包括了淚膜不穩(wěn)定，淚液缺乏引起的干燥，還包括眼表上皮病理改變發(fā)生的干燥癥狀。本研究雖然在所有的樣本中均檢測(cè)出IFN-γ與IL-17A兩種淚液蛋白的濃度，但是并未發(fā)現(xiàn)干眼組和正常對(duì)照組兩種蛋白濃度存在有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異。所以本研究中淚液IL-17A與IFN-γ兩種細(xì)胞因子的濃度并不能成為判斷炎癥因素參與干眼發(fā)病的指標(biāo)，但病例組IFN-γ濃度中位數(shù)較對(duì)照組高，能夠提示病例組淚液中的IFN-γ濃度與正常對(duì)照組有一定差異。本實(shí)驗(yàn)中兩組淚液中IL-17A濃度并未發(fā)現(xiàn)差異，但SⅠt結(jié)果與淚液樣本中IL-17A濃度呈正相關(guān)。淚液分泌的量與IL-17A濃度存在正相關(guān)性，說(shuō)明被檢者淚液的分泌量與細(xì)胞因子的濃度有關(guān)，病例組的淚液分泌量明顯少于對(duì)照組，但兩者的IL-17A濃度并沒(méi)有差異，由此推斷被檢者IL-17濃度與SⅠt結(jié)果存在正相關(guān)性，可能IL-17濃度的增加對(duì)淚液的減少分泌是一種保護(hù)性因素。兩組患者SⅠt結(jié)果BUT結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)上均有顯著性差異，說(shuō)明兩組患者在淚液的質(zhì)和量都存在明顯差異。

本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中存在諸多不足，實(shí)驗(yàn)沒(méi)有統(tǒng)一收集淚液的時(shí)間，并不能確定上午下午被檢者淚液中蛋白含量是否一致。而且針對(duì)患者的主訴并未使用調(diào)查表記分制和角膜熒光素染色記分制來(lái)評(píng)估，未能發(fā)現(xiàn)臨床癥狀的特異性與淚液中炎性因子的相關(guān)性，因此可能對(duì)本研究結(jié)果造成一定的影響。進(jìn)一步的研究中，應(yīng)該結(jié)合干眼患者癥狀體征評(píng)分表，能夠更加明確患者的臨床癥狀與檢查的相關(guān)性。并且在一天內(nèi)的不同時(shí)間收集患者淚液可以獲得淚液中細(xì)胞因子的變化規(guī)律，還應(yīng)該對(duì)比治療后的同一批患者淚液，以觀察細(xì)胞因子的變化，分析淚液中的致炎因子與疾病發(fā)病與轉(zhuǎn)歸的關(guān)系。

［1］中華醫(yī)學(xué)會(huì)眼科學(xué)分會(huì)角膜病學(xué)組.干眼臨床診療專(zhuān)家共識(shí)（2013年）［J］.中華眼科雜志，2013，49（1）：73-75.

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Analysis of IFN-Gamma and IL-17 Vytokine Determination in Dry Eye Tears by Cytometric Bead Assay

Meng Ziwei Chong Xiaoxia
（Department of Ophtalmology，Inner Mongolia Medical University Affiliated Hospital，010030，China）

ObjectiveThe concentrations of two cytokines IFN-γ（Interferon-γ）and IL-17（INTERLEUKIN-17）in tear in dry eyes and normal control group were measured by Microsphere method（Cytometric Bead Array，CBA，which is a micro-sample multiple protein quantification technique），and the role of inflammatory factors in the pathogenesis of dry eye was investigated.2.Analysis of the correlation between the concentrations of IFN-γ and IL-17 two cytokines in tear and the Clinical examination results：MethodsFor the 2015-2016，Inner Mongolia Medical University affiliated hospital ophthalmic outpatient clinic patients，including vision，tear film rupture time（break up Time，BUT），tear secretion experiment I（Schirmer i test，SⅠt），According to Japan Dry Eye Standard（2005）screening functional Dry eye patients 21 cases（21 eyes；14 cases of the right eye，7 cases left eye，the male 4（4 eyes，2 case left eye，2 case right eye）female 17（17 eyes；12 cases right eye，5 case left eye），eye screening according to patient conscious symptom more serious side.Screening healthy volunteers in 18 cases（18 eyes，11 right eyes，7 left eyes）According to the normal control group.Among the men 4（4 eyes，2 cases left eye，2 case right eye）female 14（14 eyes，9 cases of right eye，5 case left eye），eye selection and case Group Sex match（two group between men and women in each side of the proportion of close to 1：1）. The two groups of objects were collected by capillary method.The concentration of IFN-γ and IL-17 in tear samples was detected by CBA method，and the correlation was correlated with clinical examination results.ResultsThere was no statistically difference between the age and sex of the normal group and the control group（P=0.558）.There were statistically significant differences between the two groups of SⅠt（P＜0.001）；the correlation between IL-17 concentrations and S-t results in two groups of tear samples was statistically significant（r=0.38，P=0.001）；the correlation of SⅠt results with BUT results was statistically significant（P＜0.001）. ConclusionThe concentrations of cytokines in tear in two groups were not found statistically significant，but the median number of IFN-γ concentrations in the case group was higher than that of the control group.There are significant differences in statistics between s t and BUT results in two groups，indicating that the traditional method detection is still irreplaceable.And the SⅠt and BUT are sensitive indices for evaluating dry eyes.The IL-17 concentration of the detector and the SⅠt results are positively correlated，and the increase of IL-17 concentration is a protective factor in reducing tear secretion.

Dry eye；Cytometric bead assay；IFN-gamma；Interleukin-17

R777.34

A學(xué)科分類(lèi)代碼：32037

1001-8131（2017）03-0230-03

2017-03-15