磁性石墨烯固相萃取—高分辨質譜法快速測定動物源性食品中磺胺類藥物殘留

崔曉娜++葛愛民++李汝春++董彥莉

摘要：采用高效液相色譜-靜電場軌道肼高分辨質譜技術，建立了動物源性食品中13種磺胺類藥物殘留的磁性石墨烯固相萃取-高分辨質譜分析方法。樣品采用0.1%的甲酸/乙腈提取，目標物通過磁性石墨烯粉吸附，除去雜質，然后再解析目標物的方法獲得干凈的樣品基質。經Waters UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱分離，液相色譜-高分辨質譜儀進行檢測。結果表明，13種目標物在2.0～50.0 μg/L范圍內線性關系良好（r2>0.99）。在動物源性食品基質中，目標化合物在2、5、10 μg/kg 3個加標水平的平均回收率在77.8%～98.4%，相對標準偏差（RSD）為4.1%～10.1%。該方法凈化速度快、效率高，可用于動物源性食品中磺胺類藥物殘留篩查檢測。

關鍵詞：磁性石墨烯固相萃取（MSPE）；高分辨質譜法；動物源性食品；磺胺

中圖分類號： TS207文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）09-0151-04

磺胺類藥物為合成的廣譜抗菌劑，對多數革蘭氏陽性菌和陰性菌有效。由于磺胺類藥物在體內作用時間和代謝時間較長，通過任何途徑攝入的磺胺都有可能在人體中蓄積，蓄積到一定值的藥物對人體機能是有害的[1]。目前，我國對磺胺類及其增效劑的使用有比較明確的規定。我國農業部第235號公告中規定，禽肉類產品中磺胺類總量不得超過 0.1 mg/kg；日本肯定列表中將動物源性食品的最低限量定為 0.02 mg/kg；歐盟2377/90/EEC中明確規定，在所有動物源性食品中磺胺類殘留總量不能超過0.1 mg/kg[2-3]。

磁性石墨烯是由石墨烯化學制備而成，磁性石墨烯納米粒子因具有很多特殊的磁性質，比如超順磁性、高矯頑力、低居里溫度、高磁化率等，并且在磁流體、數據存儲、催化、污染物處理等很多方面都已有廣泛的研究和實際應用。所以石墨烯與磁性納米粒子復合成的磁性石墨烯受到了極大的關注，并為石墨烯的應用研究發展出了新的方向[4-6]。

目前，磺胺類及其增效劑殘留的測定方法有高效液相色譜法配合紫外檢測器、熒光檢測器和質譜檢測器[7]。液相色譜-三重四極桿串聯質譜（LC/MS/MS）可以在一次分析中定量和鑒定數百種目標化合物，具有很高的選擇性和靈敏度。但是，這種方法需要采用多種已知化合物優化儀器參數，因此不能用于篩查未知化合物。基于Orbitrap技術，Exactive 具有極高的質量分辨率，從而保證了分析結果高質量準確度，并可以準確地區分復雜樣品中同時洗脫出的具有相同質量數的化合物，高達3個數量級的動態線性范圍，可輕松分析受復雜基體干擾的痕量化合物[8-10]。

本研究建立了動物源性食品中13種具有代表性的磺胺類藥物增效劑的快速前處理和高分辨質譜法聯用的測定方法，該方法快速、準確，為監控動物源性食品中磺胺類藥物增效劑殘留提供了技術支持。

1材料與方法

1.1試劑與材料

1.1.1標準物質磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺-5-（對）甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧噠嗪、磺胺氯噠嗪、磺胺-6-（間）甲氧嘧啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺甲基異[XCZ1.tif]唑、磺胺喹[XCZ1.tif]啉，均購自DR.公司，純度均大于99%。

1.1.2試劑與耗材乙腈，甲醇均為色譜純（Fisher）；無水硫酸鈉，分析純（煙臺市雙雙化工）；甲酸，色譜純（TEDIA）；水，GB/T 6682規定的一級水；磁性石墨烯，實驗室制備；硫酸銅，優級純（天津市北聯精細化學品開發有限公司）；1-（2-吡咯偶氮）-2-萘酚（PAN），分析純（北京化學試劑有限公司）；C18粉（天津艾杰爾）。

1.1.3儀器液相色譜儀，Thermo UltiMate3000，靜電場軌道肼質譜儀（Thermo EXACTIVE）；分析天平，感量0.1 mg和0.01 g各1臺；離心機，5810型（Eppendorf公司）；均質器（T25型，IKA公司）；振蕩器（MMV-1000W，ETELA公司）；氮吹儀（N-EVAP）；渦流混勻器（IKA MS basic）。

1.1.4標準溶液配制

磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺-5-（對）甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧噠嗪、磺胺氯噠嗪、磺胺-6-（間）甲氧嘧啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺甲基異[XCZ1.tif]唑、磺胺喹[XCZ1.tif]啉：用乙腈溶解，按純度標示折算配制成100 μg/mL的標準儲備液。

1.2試驗方法

1.2.1樣品提取

準確稱取2.00（±0.02）g待測樣品置于100 mL離心管中，加入5 g無水硫酸鈉，2 g氯化鈉，10 mL 0.1% 甲酸/乙腈，均質2 min，10 000 r/min離心10 min，將上清液轉入另一干凈離心試管中，重復提取殘渣1次，取上清液合并，加入10 mL正己烷，振蕩5 min后靜置，去掉上層正己烷層。將提取液旋轉蒸發至干，加入3 mL乙腈/水溶解，待凈化。

1.2.2樣品凈化

準確稱取20 mg磁性石墨烯于10 mL離心管中，分別加入2 mL丙酮、甲醇和去離子水，依次清洗磁性石墨烯。取5 mL上清液入離心管中，渦混10 min，靜止萃取5 min。用磁鐵將磁性石墨烯聚集到離心管底部，棄去上清液，將磁性石墨烯轉移至另1個干凈的離心試管中，加入 1 mL 乙腈-氨水（體積比為95 ∶5），渦旋2 min洗脫，重復洗脫4次，合并洗脫液，氮氣吹干，流動相定容至1 mL，過 0.22 μm 濾膜，進行質譜測定分析。

1.2.3液相色譜條件

色譜柱：Waters UPLC BEH C18（2.1×100 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃，流速：0.3 mL/min，進樣量：20 μL；流動相：A：0.1%甲酸水，B：甲醇，梯度洗脫程序：0→2.0 min，由5% B→20% B；2.0→6 min，由20% B→80% B；6.2 min，5% B，平衡3 min。

1.2.4質譜條件

全掃描正離子模式（質量范圍100～1 500）；分辨率：50 000；自動增益控制（AGC）目標值：10e6；加熱點噴霧離子源條件：噴霧電壓：2 200 V，離子傳輸管溫度：280 ℃，鞘氣氣壓：32 au，氣化室溫度：200 ℃。13種化合物的質譜參數詳見表1。

2結果與分析

2.1質譜條件的優化

2.1.1色譜柱的選擇

本研究檢測的13種磺胺類藥物中磺胺-5-（對）甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺-6-（間）甲氧嘧啶分子量相同，因此，不同目標物的分離要考慮化合物性質，在提高分離速度和靈敏度的同時，達到最佳的目標物分離效果。通過比較Waters UPLC BEH C18（粒徑1.7 μm）和Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（粒徑1.8 μm），以及柱長分別為2.1×100 mm、3.0×100 mm的2種不同規格的色譜柱，在分離效率和目標物響應值方面，柱長為2.1×100 mm Waters UPLC BEH C18更好一些。

2.1.2流動相的選擇

磺胺類藥物在正離子模式下響應值較高，通過在水溶液中加入酸性溶液的方式測試其響應值。分別比較了甲醇/0.1%甲酸水溶液、乙腈/0.1%甲酸水、乙腈/10 mmol/L乙酸銨、甲醇/10 mmol/L乙酸銨溶液作為流動相，在電噴霧源ESI+方式下，在甲醇/0.1%甲酸水溶液組成的流動相中，質譜的離子化效率較其他流動相條件響應值高，峰形好，因此本研究選擇甲醇/0.1%甲酸水作為流動相。

通過改變甲醇/0.1%甲酸水不同的起始比例，經多次進樣分離，結果表明，在采用梯度洗脫的條件下，起始流動相甲醇比例在5%時，磺胺-5-（對）甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺-6-（間）甲氧嘧啶能夠得到較好地分離。在本研究的色譜條件下，13種化合物的出峰情況見圖1。

2.2前處理條件的優化與比較

2.2.1提取試劑的選擇

磺胺類藥物其結構中均含有多個胺基團，在酸性條件下容易形成正離子，因此，在提取試劑中加入酸性溶液，可以提高提取效率和離子化效果[11]。在提取試劑選擇方面，分別比較了0.1%的甲酸乙腈、0.1%的甲酸甲醇、0.1%的甲酸乙酸乙酯的提取效率，結果表明，0.1%的甲酸乙腈提取效率較高，同時加入2 g氯化鈉能夠使乙腈層和水層較好地分離，避免乳化現象出現。

2.2.2凈化吸附劑的優化

QuEChERS（分散固相萃取）方法的原理是通過吸附粉末的吸附作用而達到凈化的效果，此種凈化方法主要去除的是極性中小分子雜質，而液質聯用殘留分析中主要用到的電噴霧電離源（ESI源）分析的就是極性化合物，因此二者相互結合，可以發揮最大的檢測效率[12-13]。利用質譜在全掃描方式下對ODSC18和MSPE凈化效果進行考察，從圖2可以看出，MSPE方法凈化完后一些中極性和分子量較大的雜質被除去，綜合比較，在雜質凈化方面MSPE要優于C18。

2.3磁性石墨烯凈化方法與國標、行標的比較

在GB/T 21316—2007中前處理凈化采用的是液液萃取方法，SN/T 3155—2012中肉及肉制品的凈化采用的是過C18固相萃取柱的方法[14-15]，根據3種前處理方法，分別添加質量濃度為0.01 mg/kg的標準物質在空白樣品當中，磺胺類藥物的平均回收率見表2。

2.4方法的線性、精密度、檢測限和定量限

考察了試驗方法及儀器條件的線性及精密度，選取不同的[CM（25]動物源性食品，分別添加質量濃度為[KG*5]2.0、5.0、10.0 μg/kg 的標準物質，線性回歸方程、相關系數、回收率、RSD值見表3。

3結論

本研究采用高效液相色譜-靜電場軌道肼高分辨質譜，磁性石墨烯凈化技術，建立了動物源性食品中磺胺類藥物殘留的液相色譜-高分辨質譜分析檢測方法。采用磁性石墨烯固相萃取作為凈化材料，提高了樣品前處理效率，降低了環境污染，為監控動物源性食品中磺胺類藥物增效劑殘留提供了有力的技術支持。

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