不同滅菌方法對茜草組織培養污染率控制的研究

陳建+常權記

摘要：利用不同滅菌方法對茜草外植體進行處理，觀測組織培養污染率、愈傷組織誘導率。實驗表明：10%高錳酸鉀溶液浸泡3分鐘效果最佳，污染率30%，愈傷組織誘導率25%；75%酒精溶液滅菌10s處理效果較差，污染率60%，愈傷組織誘導率為10%。

關鍵詞：茜草；滅菌；組織培養；污染率；誘導率

中圖分類號：R282 文獻標識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2017.14.019

茜草（Rubiasylvatica），又名鋸鋸藤、紅茜草、掛拉豆、小血藤、過山龍等， 茜草科茜草屬，為多年生攀援草本植物。其味苦， 歸肝心經， 有涼血止血作用，可用于治療吐血、外傷出血，經脈阻塞、關節麻木、跌撲腫痛等，其成分具有消炎、抗腫瘤、抗氧化、清除自由基、抗輻射、鎮咳祛痰等功效，在醫藥上具有很高的應用價值[1]。

自然界茜草生長緩慢，野生茜草根莖自然產量低，茜草的藥用價值主要是在根莖，由于人們的大量采挖，導致野生資源趨于枯竭。野生種馴化移栽成活率低。為了保護國內茜草品種以及產量資源，對野生品種進行馴化，滿足茜草生產規模化栽培的需要，彌補國內茜草資源不足，開展茜草快速繁殖及組織培養的研究就顯得更為迫切和重要。本試驗是探究不同滅菌方法對組織培養污染率控制，經過不同滅菌方法的處理，旨在探索出最適組織培養的滅菌方法，使其達到快速繁殖甚至工廠化提供參考。

1材料與方法

1.1材料

茜草原材料采自陜西省安康市漢濱區長嶺村火車道旁。外植體采用當年生生長健壯、污染較少的幼嫩枝條為實驗材料，直徑為0.1～0.2厘米。

1.2培養基及培養條件

本實驗使用MS+2.4-D2.0毫克/升/l+KT0.1mg/l[2]。培養基pH調至6.0。在26℃溫度條件下，光照1000lx，環境相對濕度70%～80%。莖段接種平放和斜插入培養基，葉片接種時葉片正面朝上，平放在培養基上[3]。

1.3實驗處理

消毒劑選擇：

A1：0.1%次氯酸鈉15min+75%酒精10S+0.1%氯化汞8S

A2：10%高錳酸鉀溶液3min+75%酒精10S+0.1%氯化汞8S

A3：0.1%過氧化氫溶液10min+75%酒精10S+0.1%氯化汞8S

A4：75%酒精10S+0.1%氯化汞8S

在消毒劑選擇中，A1：次氯酸鈉消毒后，用無菌水清洗3次，75%酒精消毒后，無菌水清洗3次，0.1%氯化汞滅菌后用無菌水清洗5次。A2：高錳酸鉀消毒后，用無菌水清洗3次，用保鮮膜包裹，靜置8小時[4]，75%酒精消毒后，無菌水清洗3次，0.1%氯化汞滅菌后用無菌水清洗5次。A3：過氧化氫消毒后，用無菌水清洗3次，用保鮮膜包裹，75%酒精消毒后，無菌水清洗3次，0.1%氯化汞滅菌后用無菌水清洗5次。A4：75%酒精消毒后，無菌水清洗3次，0.1%氯化汞滅菌后用無菌水清洗5次。全部外植體邊使用邊切，保證外植體的生理活性。

2 實驗結果及分析

不同滅菌方法對污染率及愈傷組織誘導的影響（污染率=污染外植體/接種外植體數×100%，愈傷組織誘導率=發生愈傷組織數/接種外植體數×100%）。

由表1得出：使用不同滅菌方法的處理后，效果最好的是10%的高錳酸鉀溶液，污染率30%，愈傷組織誘導率也較高，為25%；效果最差為只使用75%酒精+0.1%氯化汞的方法，污染率為60%，愈傷組織誘導率10%。10%的高錳酸鉀氧化性比較小，對外植體的損害較小，雖然消毒滅菌時間比較長，但是效果比較明顯，能夠顯著誘導愈傷組織形成；過氧化氫處理后，因為消毒滅菌后，產生較多氧離子，對茜草損害比較大，導致不能產生較多的愈傷組織。使用氯化汞消毒滅菌時，由于其毒性大，對外植體損害大，因此使用氯化汞只滅菌8S。

3 分析討論

有學者經過多種滅菌方法對外植體進行滅菌，得到最佳滅菌方法，即75%酒精滅菌30S，后用10%次氯酸鈉滅菌20分鐘處理。植物組織培養過程中，污染是影響外植體誘導形成愈傷組織的主要因素。植物組織培養中用的外植體大多從野外直接獲取，因此通常都攜帶了自然界中的菌種，因此造成外植體誘導愈傷組織污染率較大。

本實驗使用了10%高錳酸鉀溶液滅菌三分鐘，清洗后用75%酒精滅菌10S，清洗3次后使用0.1%氯化汞8S，清洗5次，進行接種，最終得到了較適合的滅菌方法，取得了較好效果，為以后茜草組織培養研究提供理論上的參考。

本次試驗中，加入7.0克/升瓊脂[5]，采用高壓蒸汽滅菌，設置滅菌溫度為121℃，滅菌時長25分鐘，培養基在滅菌前測得pH為6.0，培養基凝固。滅菌后培養基未凝固，顏色偏黃。具體原因有待進一步驗證。

參考文獻

[1]張麗萍，楊春清，王瑞芳，等.181種藥用植物繁殖技術[M].北京：中國農業出版社，2004：348.

[2]何俊平，■小云.不同培養基配方對鐵皮石斛生根培養的影響[J].江蘇農業科學，2013，41（02）：57-59

[3]曾慶玲，尹書亮，魏靜.外植體不同長度及接種方式對馬尾松愈傷組織誘導的影響[J].林業科學，2014，62（02）：175-

183.

[4]王雋.馬鈴薯的高錳酸鉀消毒[J].福建農業科技，1990，4（32）：38.

[5]鞠倩.生長調節劑及蔗糖濃度對彩葉草組織培養物迷迭香酸含量的影響[D].山東：山東農業大學，2007.

作者簡介：陳建，在讀本科生，研究方向：農學；常權記，本科學歷，副教授，研究方向：設施栽培。