紅平菇液體培養條件的優化

王殿振++賀曉龍++趙瑞華++房云云++任桂梅++劉月芹

摘要：為了優化紅平菇液體培養條件，更好應用于生產實踐，本試驗采用Box-Benhnken中心組合試驗和響應面分析法，以溫度、pH值、維生素B1含量為自變量，以紅平菇菌絲體干質量為響應值進行了優化。先分別探究了不同因素對其生長的影響，確定最佳水平，然后采用響應面法擬合出最佳培養條件，最后結合實際驗證得出了紅平菇液體菌種的適宜培養條件。結果表明，紅平菇液體培養適宜條件，培養溫度為32 ℃，pH值為6.0，維生素B1含量為 16.0 mg/L。在上述條件下，紅平菇菌絲體干質量達10.19 mg/mL，與方程預測10.34 mg/mL結果一致，比優化前7554 mg/mL提高了34.895%，表明所得模型有一定的生產實踐指導意義。

關鍵詞：紅平菇；菌絲干質量；液體培養基；響應面

中圖分類號： S646.1+4文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）09-0105-04

紅平菇（Pleurotus djamor），在真菌分類學上屬于真菌門層菌綱傘菌目側耳科側耳屬，別稱紅側耳、桃紅平菇[1-3]，是熱帶、亞熱帶地區木腐菌類，菌絲生長快，出菇早，產量高，子實體色澤鮮艷，味道鮮美，是一種“能吃能觀賞”的珍稀蕈菌[4]。紅平菇子實體營養豐富，屬于低脂肪、高蛋白的健康食品，纖維素含量達到25%以上[5]；含多種人體必需和非必需的氨基酸、維生素和礦物質，具有抗腫瘤、抗菌、提高機體免疫力等功能；產量與生物學效率高[6-8]。

目前，紅平菇雖然在國內已被廣泛研究，1991年，河北農業大學園藝系李明等從泰國曼谷農業大學引進了1株高溫型T-紅平菇，通過3年的研究，掌握了該菌株的生物學特性，取得了一定的研究進展[9]。賴萬年曾進行過紅平菇深層發酵培養的研究[10]，但關于紅平菇液體培養方面的報道還很少，而相對于傳統制種和栽培方式而言，液體培養技術具有不可比擬的優勢，更容易滿足大規模工廠化生產的需求，是食用菌產業化發展的必然趨勢。本試驗旨在通過對紅平菇在不同維生素B1濃度、不同pH值、不同溫度時應用響應面法進行液體培養條件的優化，為紅平菇液體培養提供一定的參考依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌種

紅平菇菌種由延安大學生命科學學院食用菌實驗室提供。

1.1.2培養基

固體培養基：稱取去表皮洋蔥200 g，切片，沸水煮30 min，8層紗布過濾，取濾液，加入已稱量好的藥品（葡萄糖20 g、酵母膏5 g、磷酸二氫鉀1.5 g、硫酸鎂0.5 g、維生素B1 10 mg、瓊脂15 g），加熱攪拌溶解，定容，分裝試管（8 mL/管），121 ℃滅菌30 min，無菌檢驗，備用。

液體培養基：方法同上，去掉瓊脂，配成后裝入三角瓶（規格為150 mL）中，50 mL/瓶，121 ℃滅菌30 min，無菌檢驗，備用。

1.1.3試劑

DNS試劑：取6.3 g 3，5-二硝基水楊酸和 262 mL 2 mol/L的氫氧化鈉溶液加到含192 g酒石酸鉀鈉的熱溶液中，再加5 g苯酚和5 g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定溶至1 000 mL，于棕色瓶中待用[11]。

1 mg/mL葡萄糖標準溶液：葡萄糖干燥至恒重，準確稱取1.00 g葡萄糖，用蒸餾水溶解并定容至1 000 mL。

1.2方法

1.2.1菌株活化

將母種接種于斜面培養基中，于25 ℃培養8 d，制得活化菌株。

1.2.2菌種培養

將活化后的菌種制成菌懸液，并且接種于液體培養基中，每瓶接種1 mL，于25 ℃、180 r/min條件下恒溫振蕩培養。

1.2.3生長曲線的繪制

葡萄糖標準曲線的繪制試驗見表1。以葡萄糖含量為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線（圖1）。

還原糖含量測定：按表2添加試劑，搖勻，沸水浴5 min，取出迅速放入冷水中，降到室溫時，加蒸餾水定容至25 mL，搖勻，測定吸光度D550 nm。

菌絲干質量的測定：濾紙烘干至恒質量，質量記為m1；每天取3個三角瓶，真空泵抽濾，得到菌絲體與菌液，菌液放在冰上用于還原糖的測定，菌絲與濾紙烘干至恒質量稱量，質量記為m2。m2-m1即為菌絲干質量。

根據還原糖含量的變化和菌絲干質量的變化繪制菌絲生長曲線。

1.2.4單因素試驗

溫度對菌絲生長的影響：將菌懸液接種于液體培養基中，分別置于20、25、30、35、40 ℃條件下培養，培養結束后測定還原糖和菌絲干質量，每個溫度設3個重復。

pH值對菌絲生長的影響：接種方法同上，pH值設5個梯度：pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，培養結束后測定還原糖和菌絲干質量，每個梯度設3個重復。

維生素B1濃度對菌絲體生長的影響：接種方法同上，維生素B1濃度設5個梯度，分別為0、5、10、15、20 mg/L，培養結束后測定還原糖和菌絲干質量，每個梯度設3個重復。

1.2.5響應面法優化試驗

根據單因素試驗結果，優化最佳條件的范圍，采用Box-Behnken試驗設計原理[12]，運用Design Expert 8.0.6軟件設計3因素3水平響應面試驗，分別以影響最大的因素為自變量，菌絲干質量為響應值。Box-Behnken試驗因素水平見表3。

2結果與分析

2.1紅平菇基礎試驗

2.1.1紅平菇生長曲線

從圖2可以看出，紅平菇在培養后2 d開始生長，8 d左右生長速率達到最大，10 d菌絲干質量達到最大，菌絲干質量整體曲線呈增長趨勢，繼續培養菌絲體干質量基本保持不變，符合其生長規律。故確定紅平菇液體培養最佳時間為8 d。

2.1.2紅平菇還原糖含量測定

從圖3可以看出，在前2 d還原糖含量呈下降趨勢，這可能是培養基經高溫滅菌后，某些淀粉類物質降解的還原糖為紅平菇菌絲體的初期生長提供速效碳源，在2～12 d，還原糖含量整體呈上升趨勢，但在4 d時含量急劇下降，變化比較明顯，可能是碳源物質的消耗和菌絲體數量的增長，使得培養后期還原糖含量下降。

2.2單因素試驗

2.2.1不同溫度對紅平菇菌絲體生長的影響

從圖4、圖5可以看出，在溫度為20～35 ℃時，隨著溫度提高菌絲干質量呈上升趨勢，還原糖含量呈下降趨勢，可能是菌絲體生長旺盛，還原糖消耗較快；當溫度高于35 ℃時菌絲干質量下降，生長速度明顯減慢，還原糖含量也開始上升，可能是菌絲體活力下降，還原糖消耗減慢。表明紅平菇在溫度為35 ℃時生長最好。

2.2.2不同pH值對紅平菇菌絲體生長的影響

從圖6、圖7可以看出，pH值在4～6時，隨pH值增加菌絲干質量呈上升趨勢，還原糖含量呈下降趨勢；pH值為6時，菌絲干質量達到最大，還原糖含量也較低。pH值在6～8時，菌絲干質量和還原糖含量都降低。表明紅平菇最適pH值為6。

2.2.3不同濃度維生素B1對紅平菇菌絲體生長的影響

從圖8、圖9可以看出，維生素B1濃度為0～15 mg/L時，菌絲干質量隨著維生素B1濃度的增加呈上升趨勢，還原糖含量呈下降趨勢；濃度為15～20 mg/L時紅平菇菌絲干質量下降，還原糖含量有所增加。試驗結果表明，紅平菇最適維生素B1濃度為15 mg/L。

2.3響應面優化試驗

2.3.1Box-Benhnken設計方案及試驗結果

在單因素試驗結果基礎上，根據Box-Behnken中心組合設計原理，以溫度、pH值、維生素B1含量為自變量，以紅平菇菌絲干質量為響應值，進行響應面分析試驗，試驗設計及結果見表4。 2.3.2回歸方差分析

由表4數據擬合的全變量編碼水平的二次回歸方程（1）菌絲干質量=-7.877 05-0.145 55A+3.020 82B+0.358 61C-3.389 50×10-3AB-3.527 75×10-3AC+0.011 944BC+2.152 73×10-3A2-0.255 17B2-9847 17×10-3C2。

從表5可以看出，對紅平菇菌絲干質量所建立的二次多項模型具有顯著性；失擬項不顯著（P=0.654 3>0.05），表明回歸方程擬合充分，可以用此模型對紅平菇菌絲生長進行分析。顯著性檢驗表明，溫度對菌絲干質量極顯著，維生素B1含量對菌絲干質量影響顯著，pH值對菌絲干質量影響顯著，各因子對菌絲干質量的影響程度為：A（溫度）>C（維生素B1）>B（pH值）。各交互項按影響大小排序依次為AC、BC、AB，表明不同因素對菌絲干質量的影響不是簡單線性關系。

2.3.3響應面分析

根據回歸曲線作出的響應面曲面圖和等高線圖可直觀地考察出不同因素對菌絲體干質量的影響，等高線圖的形狀反映出因素交互影響的強弱，橢圓形或馬鞍形的等高線圖表示交互影響顯著，而圓形圖則表示不顯著，結果見圖10、圖11、圖12，溫度與維生素B1的交互影響極顯著，溫度與pH值的交互影響顯著，pH值與維生素B1的交互影響不顯著。

2.3.4回歸模型預測優化值

根據回歸方程（1）分別求3個自變量的一階偏導并查出對應真實值分別為A=32 ℃、B=609、C=16.23 mg/L，菌絲干質量預測值為 10.28 mg/mL。

2.3.5優化工藝條件的驗證

考慮實際的可操作性，對優化工藝參數修正溫度為32 ℃、pH值為6.00、維生素B1含量為16.00 mg/L，對回歸優化模型的條件進行驗證，結果表明，菌絲干質量為10.19 mg/mL，與方程預測一致，表明所得模型有一定的生產實踐指導意義。

3討論

本試驗采用響應面試驗設計獲得紅平菇液體培養最優條件：培養溫度為32 ℃，pH值為6.0，維生素B1含量為 16.0 mg/L。在最優條件下，紅平菇菌絲干質量可達到了 10.19 mg/mL，比優化前7.554 mg/mL提高了34.895%。試驗結果表明，在紅平菇液體菌種培養的過程中，響應面法能有效地優化培養條件。

國內外不少學者通過響應面分析法在培養基優化方面取得了良好效果。本試驗通過響應面分析，以菌絲干質量為響應值，采用回歸擬合方程，并通過方差分析獲得了最佳培養條件，為今后紅平菇液體培養提供了技術依據。

參考文獻：

[1]卯曉嵐. 中國經濟真菌[M]. 北京：科學出版社，1998：2-3.

[2]楊新美. 中國食用菌栽培學[M]. 北京：農業出版社，1988.

[3]常明昌. 食用菌栽培學[M]. 北京：中國農業出版社，2003：121-124.

[4]黃年來. 18種珍稀美味食用菌栽培[M]. 北京：中國農業出版社，1997.

[5]張其昌，黃諺諺，賴萬年，等. 紅平菇RQ-l營養成分分析[J]. 食用菌，1995（4）：12.

[6]劉智會. 紅平菇液體菌種栽培技術和營養成分分析與多糖提取工藝[D]. 哈爾濱：東北林業大學，2006.

[7]柳會珍. C903紅平菇家庭式菌種制作技術[J]. 今日科技，1996（10）：9-10.

[8]周偉峰. 紅平菇的人工栽培[J]. 中國食用菌，2000，12（6）：24-25.

[9]李明，哈保茹，劉殿林. T-紅平菇生物學特性的研究[J]. 食用菌，1995（4）：18-19.

[10]賴萬年. 紅平菇的深層發酵培養及其色氨酸的測定[J]. 閩西職業大學學報，2000（3）：50-51.

[11]寧正祥. 食品成分分析手冊[M]. 北京：中國輕工業出版社，1998.

[12]Liang R J. Optimization of extraction process of Glycyrrhiza glabra，polysaccharides by response surface methodology[J]. Carbohydrate Polymers，2008，74（4）：858-861.