木棉褐斑病病原菌鑒定及生物學特性

秦人全++林江++王洪星++王紅剛++徐羅娜++于旭東

摘要：針對在海南發生的一種木棉葉片褐斑病，為明確該病致病病原，采用形態學鑒定方法對其致病菌進行種類鑒定，并對該病原菌的生物學特性進行了初步研究。研究結果表明，引起木棉葉片褐斑病的致病菌為半知菌亞門多主棒孢霉菌（Corynespora cassiicola）；該病原菌菌絲在PDA培養基上生長最適溫度為28 ℃、pH值為7～8，光照環境對菌絲生長無明顯影響，以麥芽糖為碳源、硝酸鈉為氮源比較適合該病原菌絲的生長。

關鍵詞：木棉；褐斑病；病原鑒定；生物學特性

中圖分類號： S436.8文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）09-0101-04

木棉Ceiba pentandra（Linn.）Gaertn.屬木棉科高大落葉喬木，原產于熱帶美洲和東印度群島。目前，廣泛引種于東南亞及非洲熱帶地區[1]，我國主要分布于廣西、云南、海南、廣東、四川、貴州和福建等地。其樹生長迅速，加之花、根、皮、木材和種子等經過不同工藝加工處理后均可利用，兼具經濟、藥用和觀賞的價值[2-5]。目前，木棉在生產中不僅是優良的林用木材和綠化樹種，而且其蒴果纖維更是優良的紡織材料，其纖維與其他天然材料相比，具有不易潮濕、抗壓力強、保暖性好和不蛀不霉變等特性，是一種極具市場前景的新型生態紡織材料[6]。由于木棉兼具優良林用、綠化和紡織等多方面的經濟價值，近年來，我國南方地區種植面積越來越大，尤其海南在綠化寶島和打造木棉之鄉等相關項目的支持下，目前，整體種植面積已達10 000 hm2[7]。關于木棉研究，主要集中于纖維開發利用和優良品種選育2個方面，然而隨著木棉種植面積的逐漸增大，必將導致病蟲害大面積發生，影響其產量和質量，而且國內外關于木棉種植中病蟲害的研究報道甚少。2014年11月在海南省儋州市木棉育苗基地大面積發生木棉褐斑病，筆者對海南多地的木棉分布區域進行采樣調查，發現該病害在海南已經大面積發生。為明確木棉褐斑病病原，本試驗通過柯赫氏法則分離純化病原菌后，采用形態學描述方法對該致病菌進行了鑒定，并對致病菌進行了生物學特性初步研究，以期為木棉褐斑病的發生及綜合防治提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試病樣

試驗分離所用病樣均采集于海南大學儋州校區農科教學實習基地中發病的木棉植株。

1.1.2供試藥品

葡萄糖、谷氨酸、KH2PO4、NaOH、甘露醇、NH4NO3、KNO3、KCl、蔗糖、MgSO4、脲、Ca（NO3）2、NaNO3、鹽酸、Fe2（SO4）3、可溶性淀粉均為分析純，廣州化學試劑廠生產；麥芽糖、瓊脂粉、α-乳糖均為生化試劑，國藥集團化學試劑有限公司生產。

1.2試驗方法

1.2.1木棉褐斑病癥狀描述

通過基地觀察木棉褐斑病的典型癥狀，記錄其發病特點，并對典型癥狀進行拍照。

1.2.2木棉褐斑病病原分離及致病性測定

取基地發病木棉葉片帶回實驗室后，采用常規組織分離法進行分離[8]。分離時取病健交界處的葉片組織，接種到PDA培養基上，置于生化培養箱中25 ℃培養5 d，期間取樣進行鏡檢。然后挑取較純菌落，進行純化處理，并對純化后的菌落、菌絲體、病原孢子等進行形態描述和顯微拍照。根據柯赫氏法則操作步驟，采用針刺法接種菌餅的方式對溫室盆栽苗進行致病性測定[9]，處理時以接種不帶菌的培養基作為空白對照，觀察記錄，5 d后對接種發病葉片再次進行分離病原。

1.2.3木棉褐斑病病原鑒定

將純化病原菌用PDA培養基于25 ℃下培養產孢后，制作臨時玻片進行顯微觀察。根據菌落特征，菌絲形態，分生孢子大小、形態及顏色等相關特征。查閱相關文獻進行比對后，確定病原菌的分類地位[10-15]。

1.2.4木棉褐斑病病原菌生物學特性研究

1.2.4.1不同溫度對菌絲生長的影響在生長良好菌落邊緣，用直徑5 mm打孔器打取菌絲塊，接種于PDA培養基上，置于5、10、15、20、25、28、30、32、35、40 ℃ 10個不同溫度中進行培養，培養7 d后用十字交叉法測量個菌落直徑，每個處理重復5次。

1.2.4.2不同pH值對菌絲生長的影響在無菌條件下，用滅菌的0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH溶液，將經過滅菌的培養基pH值分別調節至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0等8個梯度。經接種病原菌（直徑5 mm）后，置于25 ℃中進行培養，7 d后用十字交叉法測量菌落直徑，每個處理重復5次。

1.2.4.3不同碳源對菌絲生長的影響以Czapek培養基為基礎培養基，用等量α-乳糖、麥芽糖、葡萄糖、D-甘露糖和可溶性淀粉分別替代Czapek培養基中蔗糖作為碳源，配制不同碳源的培養基。然后接種病原菌（直徑5 mm）于不同碳源的培養基上，25 ℃培養7 d后用十字交叉法測量菌落直徑，每個處理重復5次。

1.2.4.4不同氮源對菌絲生長的影響以Czapek培養基為基礎培養基，用等量的NaNO3、Ca（NO3）2、谷氨酸、酵母膏、脲和NH4NO3分別替代Czapek培養基中KNO3作為氮源，配制不同氮源的培養基。然后接種病原菌（直徑5 mm）于不同氮源的培養基上，25 ℃培養7 d后用十字交叉法測量菌落直徑，每個處理重復5次。

1.2.4.5不同光照條件對菌絲生長的影響在PDA培養基上接種純化病原菌（直徑5 mm）后，分別置于全黑暗處理、全光照處理、光暗交替（光—暗周期12 h—12 h）3種光照環境中25 ℃培養7 d后用十字交叉法測量菌落直徑，每個處理重復5次。

1.2.5數據統計分析

用Excel統計軟件計算菌絲生長抑制率，采用SPSS 19.0軟件進行分析各重復處理間的方差值和不同處理間的顯著性檢驗。

2結果與分析

2.1木棉褐斑病危害癥狀

木棉褐斑病主要危害木棉葉片及莖稈，葉片發病初期，被侵染葉片首先表現為暗褐色小點（圖1-A），后期病斑逐漸擴大為圓形、梨形甚至橢圓形的不規則病斑，病斑邊緣褐色至暗褐色，中間褐色，病健交界處帶有明顯黃色暈圈（圖1-B）；發病嚴重時，中央組織壞死變脆或穿孔，或多個病斑聯合成塊，中間灰褐色腐爛，濕度大時，葉片表面出現橘黃色水珠（圖1-C）。莖稈初侵染表現為褐色小點，之后病斑逐漸擴大，成橢圓形分布在表面，呈褐色或黑色。發病嚴重時，中央組織變黑，周圍病斑聯合在一起。

2.2木棉褐斑病病原菌致病性測定

在木棉發病葉片上，初次分離共得到炭疽菌（Bacillus spp.）、鏈格孢菌（Alternaria spp.）、彎孢霉菌（Curvularia spp.）、鐮刀菌（Fusarium spp.）、多主棒孢霉（Corynespora cassiicola）和2種未知菌等7種病原菌。采用溫室盆栽苗菌餅接種方法，對分離得到的病原菌進行致病性測定。結果表明，盆栽木棉葉片在接種3 d后，可看見接種部位出現褐色小病斑，并伴有擴散趨勢（圖2-A）。連續觀察10 d后，接種葉片病斑擴大，病健交界處出現明顯黃色暈圈，并伴有葉片掉落現象。而用不帶菌的空白培養基接種后僅出現針刺的機械損傷，呈現黑色小點，連續觀察10 d，接種部位無明顯擴展（圖2-B）。對顯癥部位再次進行取樣分離，所得到的病原菌與接種病原一致。接種試驗表明，分離的病原菌是木棉褐斑病的致病菌。

2.3木棉褐斑病病原菌形態學鑒定

通過對病原菌培養菌落形態、菌絲體特征、分生孢子梗和分生孢子形態進行顯微觀察，并查閱相關病原真菌形態描述和分類文獻資料，初步確認，引起木棉褐斑病的致病菌為半知菌亞門（Deuteromycotina）、絲孢綱（Hyphomycetes）、絲孢目（Hyphomycetales）、暗色菌科（Dematiaceae）、棒孢屬（Corynespora）的多主棒孢霉（Corynespora cassiicola）。

該病原菌在PDA培養基上，菌落呈輻射狀向四周平展生長，菌落舒展，邊緣規則，絨毛細發狀，菌落培養初期顏色較淺，呈灰白色，后期逐漸變為灰褐色；菌絲體半透明、具分枝情況，初期無色，后期淡褐色。PDA培養基上培養的分生孢子梗直、細、長、稍彎或屈膝狀，垂直著生于菌絲頂端，單生或分枝。分生孢子梗產孢處膨大，淺褐色至褐色。分生孢子孔出、單生或頂生，經分離培養后變長。傳代培養2～3次后形態穩定，基部膨大，頂端鈍圓，中后部分細長直或稍彎，多數呈棍棒狀，平均大小38.92 μm×8.35 μm，光滑成熟分生孢子3～5個隔膜。

2.4木棉褐斑病病原菌生物學特性

2.4.1溫度環境對病原菌菌絲生長的影響

溫度對病原菌菌絲生長的影響見表1，病原菌菌絲在5～40 ℃不同溫度條件下均可生長，但低溫和高溫生長較為緩慢，而最適生長溫度為28 ℃，連續培養7 d后，菌落直徑平均值為68.8 mm，菌絲生長速率為9.8 mm/d。

2.4.2不同pH值對病原菌菌絲生長影響

從表2可以看出，病原菌菌絲在pH值為4.0～11.0范圍內的不同酸堿環境條件下均可生長，但pH值在5.0～9.0之間生長比較良好，其中pH值為6時，菌落平均直徑達62.80 mm。總體來說，在偏堿性條件下生長比較緩慢，微酸性條件下有利于菌絲生長。

2.4.3不同碳源、氮源對病原菌菌絲生長的影響

測定結果表明，多主棒孢霉病原菌在所選擇的5種碳源和氮源配制的培養基中均能正常生長，但不同碳源、氮源對病原菌菌絲生長的差異較為明顯。從表3可以看出，所選擇的5種碳源以麥芽糖比較適合菌絲的生長，培養5 d菌落直徑達86.60 mm，其生長速率為12.37 mm/d，其次是D-甘露糖，可溶性淀粉作為碳源的生長最慢，生長速率僅為7.68 mm/d。氮源病原菌最適生長氮源為硝酸鈉，其生長速率為8.71 mm/d，其次是硝酸鈣，以硝酸銨生長最慢。

2.4.4光照對病原菌生長的影響

通過連續培養7 d后，發現不同光照下病原菌菌絲的生長無明顯差異，無論是在連續黑暗還是在連續光照等條件下，其菌絲菌落直徑和菌落生長速率基本一致。平均生長速率值分別為13.0 mm/d和 12.8 mm/d，不同處理間差異不顯著。

3結論與討論

本試驗通過對木棉葉片上的發病部位經病原菌分離純化、致病性測定和形態特征觀察，確定引起木棉褐斑病的病原菌是多主棒孢霉菌Corynespora cassiicola。該菌在自然條件下可寄生于多種植物的種子、枯死部位或土壤中，其寄主范圍廣泛，可以侵染煙草、黃瓜、番茄、木瓜、香蕉、廣藿香和一串紅等多種植物，引起植株葉片褪綠、壞死等癥狀[16-21]。多主棒孢霉菌過去作為一種次要病害未引起相應關注，自北美熱帶地區暴發番茄棒孢霉葉斑病和橡膠棒孢霉葉斑病以來，近年來在我國已由次要病害上升為主要病害，而且危害程度日益嚴重[22]。木棉葉斑類的病害較多，危害較為嚴重的有炭疽病、擬盤多毛孢葉斑病、黑痣病和葉點霉圓斑病等，高拓等在云南紅河所分離的致病菌為尾孢屬真菌，其病原主要危害葉片，并未發現有危害樹干的情況[23]，而本試驗中所分離的多主棒孢霉病原菌，在后期進行危害調查時發現，該病原菌除危害木棉葉片外，還可危害木棉樹干，造成樹干發病部位壞死。

目前，國內學者對不同作物上的多主棒孢菌株進行了基礎生物學特性研究。不同作物上多主棒孢菌株的生物學特性有所不同。對該菌的相關生物學特性研究表明，多主棒孢的分生孢子可借風、雨或農事操作在田間傳播，遠距離的傳播以種子傳播為主，而且休眠菌絲可以在種子表皮或種皮內潛伏，成為后期危害的初侵染源。在菌落生長研究中，眾多研究表明，該菌菌絲生長最適溫度為28 ℃，產孢最適溫度為30 ℃，而萌發溫度為15～35 ℃，萌發對濕度要求較高，相對濕度達90%以上才能萌發，水滴中萌發率最高[24-26]，因此，高溫、高濕條件有利于棒孢葉斑病的流行和蔓延。通過平行比較發現，張賀對巴西橡膠樹棒孢落葉病的研究結果[24]與本結果基本一致，在微酸至中性環境中生長較好，但與羅霓等從番木瓜和木薯上所分離的多主棒孢霉測定結果[27-28]差異較大，原因可能是不同寄主植物上的生理小種之間的差異。由于供試碳、氮源與培養條件的不同，導致對碳源和氮源的利用之間也會有所差異。