紅掌帚梗柱孢葉枯病菌的鑒定

劉培培++張冰++程曉琴++王會會++馬瑞++謝昌平

摘要：紅掌真菌性葉枯病是近幾年在海南新發現的一種病害，在紅掌病害中較嚴重。田間癥狀是多從葉緣發病，發病初期葉片出現水漬狀褪綠病斑，病斑周圍有黃暈，后期葉片大面積枯萎，甚至致植株枯死。從中國熱帶農業科學院周邊采集紅掌葉枯病病葉，對該病菌進行分離培養。通過對該病原菌的形態鑒定以及rDNA-ITS序列分析，確定引起該病害的病原菌為苞葉芋帚梗柱孢菌（Cylindrocladium spathiphylli Schouties，El-Gholl & Alfieri）。此病原菌引起紅掌葉枯病在國內為首次報道。

關鍵詞：紅掌；葉枯病；病原菌鑒定；苞葉芋帚梗柱孢菌

中圖分類號： S436.8文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）09-0095-02

紅掌（Anthurium andraeanum）別稱燈臺花、花燭、安祖花，為天南星科（Araceae）花燭屬（Anthurium）多年生常綠草本花卉，原產于南美洲的熱帶雨林地區，現歐洲、亞洲、非洲皆有栽培。由于紅掌花色艷麗，花期長，近年來逐步走進家居，成為美化家庭的盆栽，備受國內外消費者喜愛。目前，我國已報道的紅掌病害主要有根腐病（Pythium splendens）[1]、炭疽病（Colletorichum destructivum/Colletorichum gloeosporioides）、細菌性葉斑病（Xanthomonas axonopodis pv.citri）、細菌性葉枯病（Pseudomonas/Xanthomonas）[2]、灰霉病（Botrytis cinerea）、褐斑病（Acremonium zonatum）、葉霉病（Cladosporium cladosporioides）、莖基腐病（Phytophthora parasitica、Pythium pringshcim）、苗枯病（Metathizium anisopliae）、根莖潰瘍病（Cylindrocladium sp.）、藻斑病（Cephaleuros virescens）。國外已報道的紅掌病害有露濕漆斑菌（Myrothecium roridum）引起的葉斑病[3]、由花葉萬年青頭孢菌（Cephalosporium dieffenbachiae）引起的葉斑病、根腐病（Calonectria crotalariae）、葉疫病（Phytophthora nicotianae）。但由苞葉芋帚梗柱孢菌（Cylindrocladium spathiphylli）引起的紅掌葉枯病尚未見報道。

海南省儋州市紅掌葉枯病在紅掌病害中較嚴重，多從葉緣發病，引起葉片大面積枯萎，弱化植株生長，甚至致其枯死，造成重大的經濟損失。本試驗主要是從形態觀察和分子鑒定兩方面進行研究，確定引起紅掌葉枯病病原真菌是苞葉芋帚梗柱孢菌（C. spathiphylli Schoulties，El-Gholl&Alfieri），從而為這種病害的防治提供理論依據。

1材料與方法

1.1病葉采集及癥狀描述

紅掌葉枯病病葉采于中國熱帶農業科學院周邊。按常規方法對田間病株癥狀進行描述及拍攝。

1.2菌株分離

采用常規組織分離法分離，無菌操作接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）上，置于室溫下培養。

1.3菌株的致病性測定

采用針刺法進行人工接種。具體方法：先用滅菌針將葉片刺傷，再將分離純化菌株的菌餅（直徑0.45 cm），貼在傷口上，處理10株。同時設與菌餅同樣大小的瓊脂塊作為對照，最后表面覆蓋已滅菌的吸水紙，用保鮮袋套住保濕培養4～7 d，觀察并記錄發病情況。

1.4病原菌菌落和形態觀察

將菌種分別接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）和水瓊脂培養基（WA）上，室溫下培養5 d后，觀察菌落的培養性狀，包括菌落的顏色、氣生菌絲是否發達、分子孢子、不孕附屬絲形態和大小，以及是否存在厚垣孢子等。采用培養基表面劃傷法來誘導病原菌分子孢子、不孕附屬絲和泡囊的產生，具體做法：用滅菌的刀片在培養基表面劃上幾刀，再置于常溫下培養5～10 d，分生孢子、不孕附屬絲和泡囊產生，然后再觀察分生孢子和不孕附屬絲的形態以及測量分生孢子、分生孢子梗和泡囊的大小。

1.5病原菌rDNA-ITS序列分析

用CTAB法提取菌絲的DNA。采用通用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′擴增菌株的rDNA-ITS片段，并委托天根生化科技（廣州）有限公司進行序列測定。對測得的供試菌株 rDNA-ITS 區段的序列，分別運用GenBank核酸數據庫中的BLAST工具軟件，在DNA序列數據庫中搜索同源DNA序列并進行比較分析，根據BLAST搜索和比較的結果，進行同源性分析。

2結果與分析

2.1田間癥狀描述

該病原菌主要危害紅掌葉片，從葉片邊緣開始發病。典型癥狀：發病初期葉片出現水漬狀褪綠病斑，然后逐漸擴大為圓形、卵圓形和不規則的淺褐色至深褐色病斑，邊緣有黃色的暈圈，發病后期多個病斑也會聯合成片，造成葉片枯死（圖1-a）。

2.2菌株的致病性測定

將分離純化后的菌種接種到健康的葉片上，經過4～7 d后的觀察，針刺法接種的葉片全部發病，且癥狀與初始分離所選葉片相同（圖1-b，圖1-c），對照葉片沒有發病癥狀（圖1-d）。以接種后發病葉片作為分離材料再次分離，所得菌與初次分離所得菌落的分生孢子形態等相同，符合柯赫氏法則。

2.3病原菌菌落和形態觀察

在PDA上培養，病原菌的菌落圓形，紅棕色，邊緣整齊且顏色較淺，氣生菌絲發達（圖2-a）。而通過在培養基表面劃傷后，菌落的刮傷處會散生許多白色粉狀物，即為病原菌的不孕附屬絲、分生孢子梗和大型分生孢子。泡囊為無色，棍棒狀，大小為4.2～5.9 μm（圖2-c）；分生孢子梗掃帚狀，一級分枝長度為14.3～22.7 μm，二級分枝長度為10.1～14.7 μm，三級分枝長為8.6～12.3 μm（圖2-c）；大型分生孢子無色，圓柱狀，兩端圓形，多數無分隔，少數1～2個分隔，其長為35.3～46.5 μm，寬為3.5～4.7 μm（圖2-b）；還可見厚垣孢子，未見有小型分生孢子產生。在WA上培養時，產生的大型分生孢子與PDA上培養產生的大型孢子基本一致（圖2-e），分生孢子梗末端膨大（圖2-d），未見有小型分生孢子產生[4]。通過對培養性狀和形態學的觀察，進行查閱相關資料，初步鑒定引起該病害的病原菌所在屬為帚梗柱孢屬（Cylindrocladium）。

2.4病原菌rDNA-ITS測序分析與同源性比較

以提取病原菌的基因組DNA為模板進行PCR擴增，3個樣品均可擴增出1條大小與預計長度符合約600 bp的特異片段。以轉化后收集的菌液進行PCR擴增，克隆的結果與基因片段PCR擴增結果一致，長度約為600 bp。片段經克隆、測序后放到NCBI進行BLAST比對（GenBank：EU285-555.1），結果表明，該病原菌目的片段的序列與數據庫中已有的苞葉芋帚梗柱孢菌（C.spathiphylli Schouties，El-Gholl & Alfieri）ITS核苷酸序列（GQ280627.1）有極大的相似性，同源性高達99%。

3結論與討論

目前，國內尚未對由苞葉芋帚梗柱孢菌引起的紅掌葉枯病報道，黃志朋對紅掌莖基腐病病原進行研究，提出帚梗柱孢霉（Cylindrocladium sp.）可侵染紅掌根莖部或莖基部引起根莖潰瘍病[5]，但未提到該病原可危害紅掌葉片，也未確定病原具體種。畢可可等對白掌病害進行研究，確定苞葉芋帚梗柱孢菌是白掌褐腐病的致病菌[6-7]，但在紅掌上還未見報道。

本研究針對紅掌葉枯病進行了病原菌分離，通過對分離菌株的形態特征和rDNA-ITS序列同源性的分析，將分離的菌株鑒定為苞葉芋帚梗柱孢菌（C. spathiphylli Schouties，El-Gholl & Alfieri），本結論為國內首次報道。該研究為有效防治紅掌葉枯病提供了理論依據，使用何種藥劑及如何有效防治有待進一步研究。此外，由于真菌引起的紅掌葉枯病和細菌引起的紅掌葉枯病在病株上產生的癥狀十分相似，所以在鑒別紅掌葉枯病病原時，可首先通過切取葉片病斑組織做顯微鏡檢查，如果發現有細菌溢留現象，則為細菌性葉枯病。

參考文獻：

[1]周曉云，游春平. 紅掌根腐病病原鑒定及其PCR檢測方法[J]. 園藝學報，2013，40（5）：989-996.

[2]梁麗雯，任希望，高志亮，等. 紅掌細菌性葉枯病病原菌的分離與鑒定[J]. 熱帶生物學報，2013，4（4）：327-331.

[3]Ben H Y，Zhao Y J，Chai A L，et al. First report of Myrothecium roridum causing leaf spot on Anthurium andraeanum in China[J]. Journal of Phytopathology，2015，163（2）：144-147.

[4]Crous P W，Wingfield M J. A monograph of Cylindrocladium，including anamorphs of Calonectria[J]. Mycotaxon，1994，51（27）：393-404.

[5]黃志朋. 紅掌莖基腐病病原菌鑒定及防治藥劑的篩選[D]. 廣州：仲愷農業工程學院，2013.

[6]畢可可，周佳暖，習平根，等. 匙葉天南星根莖腐爛病病原鑒定[C]//中國菌物學會. 中國菌物學會2009學術年會論文摘要集，2009.

[7]馬凱生. 廣州白掌主要土傳真菌病害鑒定及防治藥劑的篩選[D]. 廣州：仲愷農業工程學院，2015.