葡萄中白藜蘆醇合成酶基因的克隆及其轉化黃芪研究

孫詩雯++張笑笛++宋宇

摘要：利用RT-PCR技術從巨峰葡萄中克隆獲得RS基因的全長cDNA序列，并利用農桿菌侵染法轉化黃芪。試驗結果表明：經Vector NTI 11.0軟件分析克隆獲得的RS基因全長序列長度為1 241 bp，并帶14 bp長度的poly（A）尾巴，包含930 bp的開放讀碼框（ORF），編碼1個含310個氨基酸殘基的蛋白質。生物信息學分析結果表明：RS基因編碼白藜蘆醇合成酶，對RS基因全長序列進行蛋白質結構域分析，證明該基因具有查爾酮合成酶N端保守結構域，其長度為225個氨基酸。對黃芪進行遺傳轉化結果表明：獲得了3棵黃芪轉基因陽性植株，通過DNA、RNA以及蛋白質水平證明RS基因已經完全整合到黃芪基因組中并表達。

關鍵詞：白藜蘆醇合酶基因（RS）；白藜蘆醇；生物信息學；基因克隆；Blast2go

中圖分類號： S663.101文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）09-0038-03

白藜蘆醇（resveratrol，3，4′，5-trihydroxystilbene，簡稱Res）是1940年首次從毛葉藜蘆（Veratrum grandiflorum）的根部獲得的[1]。多年來，隨著植化技術的提高以及藥理學試驗研究的深入，人們發現Res廣泛存在于種子植物中，如葡萄[2]、花生[3]、虎杖[4]等。它具有許多醫療保健作用，如抗氧化、抗腫瘤、抗血小板凝聚、抗細菌和真菌、免疫護肝、治療心血管病以及植物雌激素作用等[5-6]，因此Res已成為科學家們高度重視的天然活性成分。白藜蘆醇合酶（resveratrol synthase，簡稱RS）是Res生物合成途徑中的關鍵酶之一，它以 4-香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A為底物催化合成Res[7]。RS基因已在多種植物和微生物中進行了轉化和表達，并在植物的代謝及調控等方面發揮生物學作用。通過植物基因工程改良植物對病原菌的抗性已成為一種有效且切實可行的策略，Res的高效抗菌能力已得到一致認可，因此基于RS基因的轉基因植物很具研究前景，其次Res的藥理活性也已日益引起人們的關注。但天然的植物中存在的Res畢竟是微量的，對RS的分子生物學研究將使利用基因工程、轉基因等生物技術生產大量Res成為可能，因此對Res和RS的深入研究將為提高植物的抗性和人類的健康水平提供有效途徑。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料（1）葡萄：巨峰葡萄，購自于水果市場；黃芪：膜莢黃芪，購自于種子公司。

1.1.2菌種和試劑（1）大腸桿菌感受態DH5α，購自于天根試劑有限公司，由筆者所在實驗室活化保存。（2）農桿菌菌種EHA105，購自于天根試劑有限公司，由筆者所在實驗室活化備用。（3）植物克隆載體pMD18-T Vector，購自于天根試劑有限公司。（4）植物表達載體pBR121，購自于天根試劑有限公司；植物RNA快速提取試劑盒，購自于美國Bio-Rad公司；PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒，購自于大連寶生物公司；羅氏Ⅱ型高效地高辛DNA標記和檢測試劑盒，購自于美國Roche公司；其他分子生物學和組織培養等相關試劑，購自于天根試劑公司和國藥集團。

1.1.3培養基大腸桿菌的培養基為LB培養基，農桿菌的培養基為YEB固體培養基和YEB液體培養基，植物材料的培養基為MS培養基。

1.2試驗方法

1.2.1葡萄總RNA的提取將從市場上買回的巨峰葡萄經過液氮處理，然后參考Bio-Rad公司植物RNA快速提取試劑盒說明書進行總RNA提取，電泳檢測提取的RNA質量，并將其保存在-80 ℃冰箱中，為下一步反轉錄備用。

1.2.2RS基因的克隆（1）cDNA第一條鏈合成：參考大連寶生物公司PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑的說明書進行cDNA第一條鏈的合成，反應體系在 42 ℃ 條件下合成1 h，待反應結束后再將反應體系轉到65 ℃條件的恒溫金屬浴中處理5～10 min，使反應體系過程中的逆轉錄酶失活，最后放置-20 ℃冰箱保存備用。（2）RT-PCR反應體系：根據GenBank中已經注冊的RS基因（基因編號為：NM_001281044.1，GI編號為：526118256）序列，利用在線ORF Finder軟件和MEME軟件尋找序列的開放閱讀框，利用Vector NTI 11.0軟件設計引物。其中引物上添加相對應的酶切位點，上游引物PF序列為：CTAC[ZZ（Z]CCGGG[ZZ）]TGGCTTCAGTCGAGGAATT，其中下劃線為SmaⅠ的限制性酶切位點；下游引物PR序列為：GTA[ZZ（Z]GAGCTC[ZZ）]TACGGTTACAAATTAAGTG，其中下劃線為SacⅠ的限制性酶切位點。PCR反應體系為100 μL，其中包括：20 μL cDNA模板，10 μL 10×Taq DNA Polymeras Buffer，8 μL 10 mmol/L dNTPs，5 μL引物PF，5 μL 引物PR，6 μL Taq DNA Polymeras，ddH2O補齊至 100 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性 30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30個循環；72 ℃延伸 10 min；4 ℃保存。（3）產物序列測序以及其生物信息學分析：PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，利用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收目的基因片段。再將純化回收的目的基因片段與pMD18-T載體連接，并將連接好的產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞中，通過藍白斑篩選試驗，并進行PCR驗證。最后將驗證的菌液以M13通用引物進行測序，該工作由北京華大公司測序完成。

1.2.3RS基因測序結果生物信息學分析將測序的結果在GenBank中進行Blast比對。利用Blast2go軟件[6-7]（http：//www.blast2go.com/b2ghome）進行生物信息學分析。利用Pfam在線軟件[8]（http：//pfam.xfam.org/）進行蛋白質結構域預測。

1.2.4RS基因轉化黃芪的研究首先繪制農桿菌EHA105的生長曲線，確定O550=0.6時候為農桿菌的對數生長期。然后將RS基因與表達載體pBR121連接，并將連接好的產物轉化農桿菌EHA105中，備用。最后，轉化筆者所在實驗室已經建立好的黃芪再生體系中，篩選抗性植株，并對抗性植株進行煉苗、移栽，最終收獲轉基因黃芪陽性植株。

1.2.5黃芪轉基因抗性植株的鑒定（1）轉基因陽性黃芪植株基因組DNA提取：參考天根公司植物DNA快速提取試劑盒說明書進行轉基因陽性黃芪植株的基因組DNA提取，然后進行純化，保存于-20 ℃冰箱備用。（2）轉基因陽性黃芪植株PCR檢測：PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個循環；72 ℃ 延伸7 min；4 ℃保存。反應結束后通過1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測。（3）轉基因陽性黃芪植株Southern blot雜交檢測：Southern blot雜交檢測參考羅氏Ⅱ型高效地高辛DNA標記和檢測試劑盒說明書進行，然后進行預雜交、雜交、洗膜和顯色。最后將濾膜，置于含有NBT/BCIP的Detection buffer中，避光靜止16 h，觀察斑點顏色變化；完成后用TE緩沖液清洗濾膜5 min，觀察、成像、記錄。（4）轉基因陽性黃芪植株RT-PCR檢測：PCR反應條件為：95 ℃預變性3 min；95 ℃ 變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 60 s，35個循環；72 ℃ 延伸7 min；4 ℃保存。反應結束后通過1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測。

2結果與分析

2.1RS基因全長序列的克隆與分析

以提取的巨峰葡萄cDNA為模版，利用設計好的引物PF和PR進行RT-PCR，結果獲得大約為1 200 bp的目的條帶。將目的條帶經過純化后轉化到大腸桿菌感受態中，通過篩選陽性菌落進行PCR檢驗和測序分析，結果表明：RT-PCR獲得的目的片段長度為1 241 bp（圖1），同時將該片段的核苷酸序列與NCBI中的序列比對，其結果與已經公布的RS基因（登錄號：AF128861）的同源性達到95%。因此，認為已經成功獲得了RS基因的全長編碼序列。

2.2RS基因全長cDNA序列生物信息學分析

通過Vector NTI 11.0軟件對已經獲得的RS基因的全長序列進行分析，獲得葡萄中的RS基因序列全長為 1 241 bp，并帶有14 bp長的Poly（A），克隆獲得的RS基因起始密碼子ATG位于194 nt處，終止密碼子TAG位于1 124 nt處。全長為1 241 bp序列中包含194 bp長度的5′端非翻譯區（UTR，untranslated region）、117 bp長度的3′端非翻譯區以及930 bp長度的開放讀碼框（ORF）區，RS基因編碼1個含310個氨基酸殘基的蛋白質，經預測編碼白藜蘆醇合成酶。

再將已經獲得的葡萄中的RS基因全長序列編輯成fasta格式文件，利用生物信息學軟件Blast2go對RS基因進行功能注釋分析和KEGG代謝途徑分析。由功能注釋結果可知，RS基因被功能注釋為白藜蘆醇合成酶。由KEGG代謝途徑注釋結果分析可知，RS基因的酶標號為EC 2.3.1.95，是黃酮類以及黃酮醇類化合物生物合成過程中的關鍵酶基因。由圖2對該基因編碼的蛋白保守域分析結果可知，獲得的RS基因全長序列包含了完成的查爾酮合成酶N端保守結構域，其長度為225個氨基酸。綜上所述，通過生物信息學分析為RS基因參與的黃酮類和黃酮醇類化合物生物合成機制的研究提供了生物信息學基礎數據支撐。

2.3RS基因轉化黃芪的研究

將已經克隆獲得的RS基因，與表達載體pBR121連接，構建成為pBR121-RS表達載體，并將其轉化到農桿菌EHA105中，最后對黃芪子葉和胚軸為外植體進行農桿菌侵染進行遺傳轉化，獲得再生植株。本試驗共分40批接種外植體2 080塊，其中子葉1 040塊，胚軸1 040塊。培養2 d后進行侵染；侵染后共培養2 d；最后篩選培養，每10 d繼代1次。培養30 d統計不定芽再生率，其中胚軸不定芽再生率為221%，子葉的不定芽再生率為15.9%。對所獲得的抗性芽進行生根、煉苗、移栽，最后共獲得抗性植株11棵（圖3）。

2.4轉基因黃芪植株的鑒定

對取得轉基因陽性的抗性11棵植株的基因組進行DNA提取，經檢測質量和純度完好，結果見圖4。

利用試驗所述方法對11棵轉基因黃芪陽性植株進行PCR檢測，檢測表達載體的左右2個區是否成功轉入到黃芪基因組中。PCR結果如圖5和圖6所示，左區擴增條帶為 750 bp 左右，右區擴增條帶為400 bp左右，均與載體左右2個區設計的PCR目的引物大小相同，初步鑒定目的基因整合入黃芪基因組中。

為進一步鑒定RS基因在黃芪基因組中的整合及轉錄，進行Southern blot雜交，結果如圖7所示，轉基因植株3棵具有雜交信號，其余8數植株無明顯信號，進一步證明目的基因已整合到黃芪基因組中進行轉錄。從雜交結果可以看出，不同植株的信號強弱不同，說明其表達量不同，可能與不同植株個體整合外源基因的拷貝數及插入位點不同有關。

3結論

本研究利用RT-PCR技術從巨峰葡萄中克隆獲得RS基因的全長序列。通過生物信息學分析該基因全長序列，并利用農桿菌浸染的方法將其對黃芪進行遺傳轉化，通過對黃芪陽性植株鑒定，從DNA、RNA以及蛋白質水平證明RS基因已經完全整合到黃芪基因組中并表達。本研究通過結合生物學知識和生物信息學分析，更進一步對RS基因的信息進行解讀，重點從轉錄組學層面上解釋了RS基因參與黃酮類和黃酮醇類化合物生物合成途徑中的關系，更明晰了白藜蘆醇的生物合成代謝的積累機制，為日后提高白藜蘆醇的定向生成提供了有價值的理論參考。

參考文獻：

[1]趙霞，陸陽，陳澤乃. 白藜蘆醇的化學藥理研究進展[J]. 中草藥，1998，29（12）：837-839.

[2]Yao L L，Dai G H，Liu Y M，et al. Resveratrol analysis in Chinese medicinal[KG*2/3]plants[KG*2/3]and[KG*2/3]grape seeds[J]. Journal of Shanghai JiaotongUniversity（Agricultural Science），2005，23（1）：31-35.

[3]田立榮，廖伯壽，黃家權，等. 花生白藜蘆醇研究進展[J]. 中國油料作物學報，2008，30（4）：522-528.

[4]謝磊，李志光，周軍. 等用不同方法提取虎杖中白藜蘆醇的比較[J]. 生物質化學工程，2007（2）：28-30.

[5]程建蕊，王振月，胡鳳，等. 白藜蘆醇在植物中的分布及其生理活性研究進展[J]. 世界科學技術（中醫藥現代化），2007，9（5）：91-96.

[6]王華，尉亞輝，王慶俐，等. 葡萄酒中白藜蘆醇的HPLC測定[J]. 西北農業大學學報，1999，27（4）：83-87.

[7]Schroder G，Brown J W，Schroder J. Molecular analysis of resveratrol synthase：cDNA，genomic clones and relationship with chalcone synthase[J]. European Journal of Biochemistry，1998，172（1）：161-169.