葡萄柚的組織培養與植株再生技術

葉維雁++劉惠民++李賢忠++王倩++何靜++夏賽

摘要：以葡萄柚無菌實生苗的上胚軸、下胚軸和葉片為外植體，研究其組織培養和植株再生技術。結果表明，葡萄柚上胚軸分化不定芽的能力最強；誘導不定芽的最佳培養基為WPM+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+AgNO3 2 mg/L+蔗糖40 g/L，培養40 d后不定芽分化率為78.33%，不定芽數為3.66個；最適生根培養基為l/2 WPM+NAA 1.5 mg/L+AC 0.1%+蔗糖40 g/L，生根率達73.33%，生根數為1.91條/株；生根苗移栽30 d后成活率達70%以上。

關鍵詞：葡萄柚；離體培養；不定芽；植株再生

中圖分類號： S666.304+.3文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）09-0034-04

葡萄柚（Citrus paradise Macf.）屬蕓香科柑橘屬常綠植物，香港稱為“西柚”，在廣東新會一帶又稱“番柑”，是甜橙和柚的天然雜交種，結果時果實懸掛成串，簇生如葡萄，因此被稱為葡萄柚[1]，為世界四大柑橘類群（寬皮柑橘類、甜橙類、檸檬來檬類、葡萄柚和柚類）之一[2]。葡萄柚果實風味獨特、柔軟多汁、酸甜可口，口感好，可用于制備新鮮果汁、罐頭和沙拉[3]，含有豐富的維生素C、柚苷和橙柑，具有消除疲勞、清熱退火、消食、減肥和護膚等特殊功效[4]，具有較高的經濟價值和藥用價值。

葡萄柚傳統種子繁殖方式的遺傳性狀易產生較大變異，而嫁接方式成本較高，很難滿足市場對良種苗木的大量需求。利用組織培養技術進行葡萄柚良種的快速繁殖可以克服常規方法費時的缺點，還可獲得具有高度一致和優良表型的群體，而且創建高效、穩定的植株再生體系可以為葡萄柚的無病苗木繁育、誘變育種及遺傳轉化創造有利條件。迄今為止，許多柑橘品種已經在組織培養與再生體系的構建上取得了成功[5-12]，而關于葡萄柚再生體系建立的報道仍很少，本試驗以葡萄柚種子萌發的無菌苗為試材，構建穩定的植株再生體系，并探討幾個相關的影響因素，以期為葡萄柚的快速繁殖、品種改良和遺傳轉化提供參考。

1材料與方法

1.1無菌實生苗的獲取

2013年11月從云南省林科院西雙版納州普文葡萄柚試驗園挑選生長結果良好的帕利斯（Perlist）品種植株，取其成熟鮮果的飽滿種子，裝入大燒杯，燒杯口用紗布封住，流水沖洗干凈表面黏液。在超凈工作臺內用75%乙醇表面滅菌 15 s，再用0.1% HgCl2浸泡20 min，無菌水沖洗8次，在無菌濾紙上剝去內外種皮，接種于1/5 WPM固體培養基上。1 L 0.1% HgCl2中滴加1～2滴吐溫-20，以提高HgCl2的殺菌效果[13]。21 d后，取無菌實生苗作為外植體供體。

1.2不定芽的誘導

1.2.1不同濃度的TDZ與NAA對不定芽誘導的影響

以WPM+蔗糖40 g/L為基本培養基，添加不同濃度的植物生長調節劑苯基噻二唑基脲（thidiazuron，TDZ）0、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L和萘乙酸（1-naphthaleneacetic acid，NAA）0.1 mg/L，共7個處理。取21 d苗齡的無菌實生苗，在上胚軸中部切取長約1.5 cm的小段，水平接種在培養基上，每處理接種20個上胚軸小段，重復3次，40 d后統計愈傷誘導率、不定芽分化率、不定芽數。

1.2.2不同濃度的AgNO3對不定芽誘導的影響

以 WPM+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖40 g/L為基本培養基，添加不同濃度（0、0.5、1.0、2.0、5.0、10 mg/L）的 AgNO3，共6個處理。取21 d苗齡的無菌實生苗，在上胚軸中部切取長約1.5 cm的小段，水平接種在培養基上，每處理接種20個上胚軸小段，重復3次，40 d后統計愈傷誘導率、不定芽分化率、不定芽數。

1.2.3不同濃度的蔗糖對不定芽誘導的影響

以WPM+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+AgNO3 2.0 mg/L為基本培養基，添加不同濃度（20、30、40、50、60 g/L）的蔗糖，共5個處理。取21 d苗齡的無菌實生苗，在上胚軸中部切取長約 1.5 cm 的小段，水平接種在培養基上，每處理接種20個上胚軸小段，重復3次，40 d后統計愈傷誘導率、不定芽分化率、不定芽數。

1.2.4不同外植體對不定芽誘導的影響

從21 d苗齡的無菌實生苗中分別選取上胚軸、下胚軸、葉片作為外植體，水平接種于WPM+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+AgNO3 2.0 mg/L+蔗糖40 g/L培養基上，共3個處理，每處理接種20個外植體，重復3次，40 d后統計愈傷誘導率、不定芽分化率、不定芽數。

1.3生根培養

當不定芽長至約2 cm時，切下長勢較好且大小相同的單芽接種于生根培養基中。生根培養基以1/2 WPM+蔗糖 40 g/L+活性炭（activated carbon，AC）0.1%為基本培養基，附加不同濃度（0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）的NAA，每處理接種20個單芽，重復3次。生根培養40 d后統計生根率、生根數，觀察根的生長情況，篩選出適合不定芽生根的培養基。

1.4煉苗移栽

挑選生長健壯的生根苗置于室內自然光下煉苗7 d，其間逐漸松開瓶蓋，使生根苗逐漸適應外界環境。挑選長勢較好、株高約3 cm、根長約8 cm的生根苗64株，洗凈根部的培養基后，移栽到由草泥炭、珍珠巖、蛭石、紅土（體積比為 2 ∶1 ∶1 ∶1）組成的混合基質中，用多菌靈液澆透基質，注意水分、光照、溫度的管理，30 d后統計成活率。

1.5培養條件

WPM培養基均添加瓊脂5 g/L；1/2 WPM培養基里大量元素減半，其他元素含量不變，含瓊脂5 g/L；1/5 WPM培養基里各元素含量均減為WPM培養基的1/5，含瓊脂3 g/L。pH值調至5.7±0.1，121 ℃高壓滅菌18 min后冷卻備用，培養溫度為（26±1）℃，光照度1 500 lx，光照時間14 h/d。

1.6數據處理

試驗數據使用SPSS 21.0進行單因素方差多重比較分析。觀測變量計算公式如下：

愈傷誘導率=產生愈傷組織的外植體數/接種的外植體數×100%；

不定芽分化率=長出不定芽的外植體數/接種的外植體數×100%；

不定芽數=長出的不定芽總數/長出不定芽的外植體數；

生根率=生根的不定芽數/接種的不定芽數×100%；

生根數=長出的總根數/生根的不定芽數；

移栽成活率=移栽成活苗數/移栽苗數×100%。

2結果與分析

2.1不同濃度的TDZ與NAA對不定芽誘導的影響

上胚軸培養7 d后兩端切口處開始膨大，12 d左右在兩端切口處有少量淡綠色愈傷組織形成，但隨后愈傷組織并無明顯增加。18 d左右在兩端切口處開始出現綠色芽點，23 d左右在綠色芽點處開始出芽，并于30 d左右達到高峰（圖1-A），40 d后不定芽的長度達1.0～1.5 cm（圖1-B），最長的約2 cm。TDZ與NAA不同的濃度組合對不定芽分化的影響是不同的，其結果見表1。在NAA濃度為0.1 mg/L的條件下，不同濃度的TDZ均可誘導上胚軸產生愈傷組織和不定芽，但愈傷誘導率、不定芽分化率及不定芽數都有所差異；而不含TDZ的培養基里上胚軸無愈傷組織和不定芽形成。TDZ濃度為1.5 mg/L時愈傷組織誘導率達到最高值，為 71.67%，顯著高于其他處理；TDZ濃度為1.0 mg/L時不定芽分化率最高，為56.67%，極顯著高于其他處理；TDZ濃度為1.0 mg/L時不定芽數最多，達到3.08個，極顯著高于其他處理。當TDZ濃度由1.0 mg/L增加至2.0 mg/L，不定芽分化率降低，不定芽數減少。由此可見，雖然TDZ是一種強力的細胞分裂素，但對于葡萄柚上胚軸不定芽的分化，其濃度并不是越高越好，過高濃度的TDZ反而會抑制不定芽的分化。

2.2不同濃度的AgNO3對不定芽誘導的影響

如表2所示，當AgNO3濃度為0.5～5.0 mg/L時，上胚軸的愈傷誘導率、不定芽分化率、不定芽數均高于對照（不添加AgNO3的處理），其中AgNO3濃度為2.0 mg/L時愈傷誘導率、不定芽分化率、不定芽數均達到最高值，分別為 85.00%、7833%、3.66個；當AgNO3濃度由2.0 mg/L增加到 5.0 mg/L 時，愈傷誘導率、不定芽分化率、不定芽數均明顯降低，當AgNO3濃度增加至10.0 mg/L時，愈傷誘導率、不定芽分化率、不定芽數都已低于對照，表明過高濃度的AgNO3對葡萄柚上胚軸愈傷組織、不定芽的誘導均具有抑制作用。

2.3不同濃度的蔗糖對不定芽誘導的影響

蔗糖濃度對上胚軸不定芽的分化有明顯影響（表3）。當蔗糖濃度為40 g/L時，不定芽的誘導效果最好，不定芽分化率和不定芽數均達到最高值，分別為76.67%和3.69個，且不定芽生長粗壯；當蔗糖濃度為20 g/L時，不定芽分化率和不[CM（25]定芽數分別低至45.00%和1.89個，不定芽生長細弱，這可能是其后期生長中碳源和能源不足導致的；另一方面，高濃度（60 g/L）蔗糖抑制了不定芽的再生，不定芽分化率和不定芽數分別只有48.33%和2.11個，這可能是蔗糖濃度過高導致瓶內空氣濕度變小或培養基滲透壓升高，形成的一些不利因素造成的。

2.4不同外植體對不定芽誘導的影響

不同外植體對葡萄柚不定芽的誘導影響很大，結果如表4所示，上胚軸和下胚軸均能分化出不定芽，而葉片始終未能分化出不定芽，其中上胚軸分化不定芽的能力最強，不定芽分化率達76.67%，不定芽數達到3.65個，均極顯著高于下胚軸和葉片。此外，上胚軸一般于接種23 d后開始分化形成不定芽，在28 d左右集中出芽，而下胚軸一般于接種25 d后才開始分化形成不定芽，在30 d左右集中出芽；由此可見，上胚軸的出芽時間要比下胚軸提前2 d左右，這在一定程度上也反映了上胚軸分化不定芽的能力要強于下胚軸，更適合作為葡萄柚不定芽誘導的外植體。

2.5生根培養

不同濃度的NAA對不定芽生根的誘導效果如表5所示，接種40 d后，除對照外均能誘導出一定數量的不定根（圖1-C），且都較粗壯，部分生根苗除有主根外，還有1～3條側根，長3～6 cm。說明添加一定量的生長素對葡萄柚不定芽的生根是必須的，其中培養基1/2 WPM+NAA 1.5 mg/L+AC 0.1%+蔗糖40 g/L的生根效果最好，生根率達73.33%，生根數為1.91條/株，均顯著高于其他培養基。當NAA濃度由1.5 mg/L增加至2.0 mg/L時，生根率和生根數分別降低至58.33%和1.31條/株，說明高濃度的NAA對葡萄柚不定芽的生根產生抑制作用。

2.6煉苗移栽

生根苗經煉苗后移栽至基質（草泥炭 ∶珍珠巖 ∶蛭石 ∶紅土=2 ∶1 ∶1 ∶1，體積比）中，21 d后幼苗開始長出新葉（圖1-D），30 d后成活率達70%以上。

3討論與結論

在植物的離體培養中，在培養基中添加一定量的植物生長調節劑可以調節外植體的激素水平，從而促進不定芽的分化和再生。TDZ是一種苯基脲衍生物，細胞分裂素活性高于6-BA和KT，作為一種有效的形態發生調節劑被廣泛用于植物組織培養[14]，范圍遍及草本植物[15-19]和木本植物[20-23]。在含有TDZ（濃度0.1～2.0 mg/L）的培養基中均能誘導葡萄柚上胚軸不定芽的分化和形成，其中以1.0 mg/L TDZ誘導效果最好。高濃度的TDZ抑制葡萄柚上胚軸不定芽的分化，當TDZ濃度大于1.0 mg/L時，不定芽分化率開始呈現下降的趨勢，不定芽數也開始減少。細胞分裂素和生長素按適當的比例組合在一起有很強的協同作用，一般情況下能更有效地促進不定芽的的分化與生長，TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L 的組合對葡萄柚上胚軸不定芽的誘導效果最好，不定芽分化率達56.67%，不定芽數達3.08個，這可能是由于TDZ 1.0 mg/L 和NAA 0.1 mg/L的濃度配比剛好達到了上胚軸直接分化不定芽的生理要求，更好地促進了DNA、RNA、蛋白質的合成，細胞的生長、分裂更加旺盛，促使不定芽的再生。

AgNO3是一種較好的乙烯抑制劑，其提高不定芽再生能力已在多種植物上得到證實[24-26]。試驗中AgNO3可明顯提高葡萄柚上胚軸的不定芽分化率，且不同濃度的AgNO3對不定芽的分化有不同的影響，培養基WPM+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖40 g/L中添加2.0 mg/L AgNO3最適合葡萄柚上胚軸不定芽的分化，不定芽分化率達78.33%，不定芽數達3.66個；在相同的激素配比下，不定芽分化率隨著AgNO3濃度（大于2.0 mg/L時）的升高而下降，此時AgNO3表現出一定的副作用；AgNO3濃度由2.0 mg/L增加至 5.0 mg/L 時不定芽分化率開始降低，不定芽數開始減少，當 AgNO3 濃度達到10 mg/L時已表現出抑制作用，不定芽分化率、不定芽數均低于不添加AgNO3的處理。這可能是由于過多的Ag+破壞了離子平衡，以及對植物體的毒害作用所致。

植物組織培養中，糖類為培養物生長發育提供碳源和能源，并有調節培養基滲透壓的作用，其中最常用的糖類是蔗糖[27]；蔗糖濃度過低，碳源和能量供應不足，導致不定芽生長不良；蔗糖濃度過高，導致不定芽失水而生長不良。葡萄柚不定芽誘導的最適蔗糖濃度為40 g/L，此時不定芽分化率和不定芽數分別為76.67%和3.69個。

植物組織培養中為獲得較高的不定芽分化率，除了篩選合適的激素組合及濃度配比外，還要選擇合適的外植體類型。以葡萄柚的上胚軸、下胚軸、葉片作為外植體進行不定芽的誘導，難易程度不同，由易到難表現為上胚軸>下胚軸>葉片，其中上胚軸的不定芽分化率最高，達76.67%，與蕉柑[28]、沙田柚[29]不定芽誘導的表現一致，而葉片始終未能形成不定芽，這可能是由于上胚軸、下胚軸、葉片所含內源激素水平不同進而對外源激素種類、濃度的要求有差別而導致的[30]。植物離體培養中不定芽的分化通常有直接發生型和間接發生型2種途徑，本研究中不定芽的分化屬于直接發生型，各試驗組合均能誘導不定芽直接形成，雖然在切口表面有1圈白色松軟的愈傷組織形成，但不定芽基本都是從材料切口表面直接形成，未經過愈傷組織階段。此外，不定芽的分化位點有2種，一種是在機械損傷處如切口，有觀點認為機械損傷能刺激細胞分裂從而促進組織分化，最后引起不定芽的分化和形成；另一種是在沒有機械損傷處也能產生不定芽，即不定芽的出現不以出現機械損傷為前提。對于葡萄柚，無論是上胚軸還是下胚軸，不定芽均在有機械損傷的兩端切面產生，沒有機械損傷的部位沒有不定芽的產生，證明葡萄柚無菌實生苗上、下胚軸不定芽的發生是以發生機械損傷為前提條件的。

離體培養條件下不定芽的生根通常須有生長素的誘導，NAA、IBA是誘導生根效果較好且十分常用的2種生長素。葡萄柚不定芽生根試驗采用NAA進行不定根的誘導，以培養基l/2 WPM+NAA 1.5 mg/L+AC 0.1%+蔗糖40 g/L的生根率最高，生根率達73.33%，生根數為1.91條/株，根系粗壯；生根試驗中生根苗主根上普遍只有少量側根（0～3條）長出，不利于移栽后生根苗的存活，這可能與葡萄柚的基因型有關。關于如何誘導葡萄柚的離體芽苗長出有大量側根的根系，還須要作進一步研究。

參考文獻：

[1]楊連珍. 葡萄柚概述[J]. 熱帶作物研究，1996（1）：67-71.

[2]姜超強，劉惠民. 云南引進葡萄柚品種葉片營養分析[J]. 山東林業科技，2007（1）：4-6.

[3]吳海波，劉惠民. 葡萄柚的栽培及研究概況[J]. 經濟林研究，2005，23（1）：69-73.

[4]史海芝，劉惠民，李賢忠. 引進美國葡萄柚果實營養分析[J]. 山東林業科技，2009（2）：28-31.

[5]敖小平，熊興耀，胡新喜，等. 高效的“大紅”甜橙實生苗上胚軸離體培養與植株再生體系的建立[J]. 植物生理學通訊，2007，43（4）：689-692.

[6]胡新喜，敖小平，鄧子牛，等. 成年態柑橘再生體系研究初報[J]. 湖南農業科學，2008（2）：11-13.

[7]張俊娥，鄧秀新. 柑橘愈傷組織植株再生及其倍性鑒定[J]. 華中農業大學學報，2007，26（2）：237-238.

[8]張家銀，郭琛，謝玉明，等. 椪柑成年態節間莖段再生體系的建立[J]. 湖南農業大學學報（自然科學版），2008，34（2）：182-185.

[9]曾艷，鄒利娟，蘇智先，等. 坪山柚上胚軸離體再生體系的建立[J]. 熱帶亞熱帶植物學報，2010，18（3）：298-303.

[10]曾艷，蘇智先，鄒利娟，等. 強德勒紅心柚離體培養與植株再生體系的建立[J]. 武漢植物學研究，2010，28（2）：218-223.

[11]徐海峰，欒愛業，曾黎輝，等. 雪柑試管苗不定根高頻率誘導和高效再生體系的建立[J]. 江西農業大學學報，2007，29（1）：148-151.

[12]金建濤，賴鐘雄，劉生財，等. 尤溪金柑離體再生體系優化及試管苗保存[J]. 福建農林大學學報（自然科學版），2014，43（3）：256-262.

[13]李浚明，朱登云. 植物組織培養教程[M]. 3版. 北京：中國農業大學出版社，2005，20

[14]徐曉峰，黃學林. TDZ：一種有效的植物生長調節劑[J]. 植物學通報，2003，20（2）：227-237.

[15]Lata H，Chandra S，Wang Y H，et al. TDZ-induced high frequency plant regeneration through direct shoot organogenesis in Stevia rebaudiana Bertoni：an important medicinal plant and a natural sweetener[J]. American Journal of Plant Science，2013，4：117-128.