帶葉兜蘭種子無菌萌發及試管成苗技術研究

田凡++顏鳳霞++姜運力++王蓮輝

摘要：為初步建立帶葉兜蘭組織培養快速繁殖體系，對帶葉兜蘭（Paphiopedilum hirsutissimum）成熟種子進行無菌萌發、原球莖分化及根誘導研究。結果表明：有機添加物香蕉對原球莖的誘導與分化有較好的促進作用；培養基配比為：1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+2.0%葡萄糖+0.5%瓊脂+0.05%活性炭，對原球莖的誘導和增殖有明顯的促進作用；不同濃度配比的6-BA和NAA對芽增殖影響不明顯，但低濃度的NAA對芽的分化影響顯著；1/2 MS+IBA 0.2 mg/L對帶葉兜蘭的根誘導效果最為理想；碎樹皮為栽培基質的移栽成活率達96%。

關鍵詞：帶葉兜蘭；無菌萌發；快繁；試管成苗；培養基

中圖分類號： S682.310.4+3文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）09-0030-04

兜蘭屬（Paphiopedilum）隸屬于蘭科（Orchidaceae）植物，主要分布于我國貴州、廣西和云南[1]。兜蘭具有很高的觀賞價值，十分珍貴，野生資源遭到過度采掘，已經到了瀕臨滅絕的邊緣，被列入《野生動植物瀕危物種國際貿易公約》的保護對象[2]。兜蘭種子沒有胚乳，在自然環境中須與真菌共生才能萌發，且萌發率極低[3]。而兜蘭的克隆增殖是世界性難題，即使能誘導出愈傷組織或幼芽，增殖率仍很低[4]。目前，利用種子非共生無菌萌發成苗是兜蘭植物規模化快繁的唯一途徑，是解決其保育問題的重要手段。

帶葉兜蘭（Paphiopedilum hirsutissimum）是兜蘭屬地生或半附生草本植物，是蘭科中最原始的類群之一，株形娟秀，花朵造型獨特，花期持久，被譽為兜蘭中的“美嬌娘”[5]。目前，關于兜蘭屬其他植物的種質保護與無菌苗快繁技術已有很多報道[6-10]，但與帶葉兜蘭相關的研究鮮有報道[11-12]。研究了帶葉兜蘭種子無菌播種與試管快速成苗體系，探討帶葉兜蘭組培快繁技術，以期為帶葉兜蘭人工快繁的規模化和產業化提供科學依據和技術支持，為最終實現帶葉兜蘭種質資源的保育及可持續開發利用奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

帶葉兜蘭（Paphiopedilum hirsutissimum）植株為貴州省林業科學研究院種質資源。5月盛花期進行人工同種異株授粉（圖1）；當年9月左右，種子干燥接近成熟，從授粉到蒴果成熟開裂需要120 d左右（圖2）。

1.2試驗方法

1.2.1種子預處理先將帶葉兜蘭種子莢流水沖洗5 h后移入超凈工作臺，用75%乙醇浸泡10 min，0.1%次氯酸鈉浸泡15 min，后用無菌水沖洗3～5次。用無菌濾紙吸干多余水分，切開種皮，將種子撒落在所配制的各種固體瓊脂培養基上。

1.2.2培養基

以1/2 MS為基本培養基。培養基中加葡萄糖30 g/L（生根為20 g/L）和瓊脂6 g/L作為固定劑，加熱完全融化后調至pH值5.2～5.4，分別裝40 mL到培養瓶中，用瓶蓋封口，每一個處理接種15～20瓶，放在蒸汽高壓鍋（120 ℃，20 min）內滅菌，室溫冷卻后待用。

1.2.2.1不同有機添加物對原球莖誘導與分化的影響

將種子分別接種到5種培養基：（M1）1/2MS+10%馬鈴薯+20%葡萄糖+0.4%瓊脂+0.1%活性炭；（M2）1/2MS+10%椰乳+2.0%葡萄糖+0.4%瓊脂+0.05%活性炭；（M3）1/2MS+10%香蕉+2.0%葡萄糖+0.5%瓊脂+0.05%活性炭；（M4）1/2MS+10%蘋果汁+2.0%葡萄糖+0.5%瓊脂+0.05%活性炭；（M5） 1/2MS+15%椰乳+2.0%葡萄糖+04%瓊脂。

1.2.2.2不同濃度6-芐氨基嘌呤（6-benzylaminopurine，簡稱6-BA）和萘乙酸（1-naphthaleneacetic acid，簡稱NAA）對芽增殖分化的影響

前期試驗分別對6-BA、NAA進行激素組合及配比試驗，篩選增殖分化有效培養基配方：（N1） 1/2MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 1.0 mg/L+2.0%葡萄糖+0.5%瓊脂+0.05%活性炭；（N2） 1/2MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+2.0%葡萄糖+0.5%瓊脂+005%活性炭；（N3） 1/2MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+2.0%葡萄糖+0.5%瓊脂+0.05%活性炭；（N4） 1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+0.1 mg/L NAA+2.0%葡萄糖+0.5%瓊脂+[JP3]0.05%活性炭；（N5） 1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+20%葡萄糖+0.5%瓊脂+0.05%活性炭。

1.2.2.3不同濃度6-BA、NAA及有機添加物對芽增殖分化的影響

（L1） 1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+3.0%葡萄糖+0.5%瓊脂+0.05%活性炭+10%馬鈴薯；（L2） 1/2MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L+30%葡萄糖+0.5%瓊脂+0.05%活性炭+10%馬鈴薯；（L3）1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+3.0%葡萄糖+0.5%瓊脂+0.05%活性炭+10%馬鈴薯；（L4） 1/2MS+NAA 0.1 mg/L+3.0%葡萄糖+0.5%瓊脂+0.05%活性炭；（L5）1/2MS+NAA 0.1 mg/L+3.0%葡萄糖+0.5%瓊脂+0.05%活性炭+10%馬鈴薯；（L6） 1/2MS+NAA 001 mg/L+3.0%葡萄糖+0.5%瓊脂+0.05%活性炭+5%椰乳。

1.2.2.4生根培養基

設置3種不同激素的生根培養基：（B1）1/2MS+吲哚丁酸（indole-3-butytric acid，簡稱IBA）0.2 mg/L；（B2）1/2MS+NAA 0.2 mg/L；（B3）1/2MS+IAA 0.4 mg/L。將分化出具有2～3張葉、高1.5 cm左右的小苗從培養瓶中取出轉入生根壯苗培養基B1～B3上。

1.2.3培養條件

1.2.3.1種子萌發、原球莖誘導及增殖評價方法

培養室溫度維持在23～25 ℃之間。接種后先暗培養3周，觀察種子吸脹膨大，有白色原球體長出，每個處理隨機調查50粒種子。萌發后置于光照強度1 500～2 000 lx，12 h/d。待種子萌發后，觀察原球莖轉綠，有葉原基出現，以白色的原球莖膨大到轉綠色小芽的多少統計萌發率（圖3、圖4）。種子在培養基上培養3個月后，調查萌發數（由于種子極其細小且數量很大，很難記數，因播種方法一致，每瓶播種的種子數量可視為一致，所以本研究只統計每瓶萌發的種子數量）。根狀莖切段在增殖培養基中培養60 d后調查增殖情況。每種處理調查50個外植體，對調查結果進行差異顯著性分析。

1.2.4煉苗與移栽

將瓶苗從培養室（恒溫室）移至與外界相通的室內放置1 d后，去瓶蓋煉苗3～7 d（培養基有輕微污染）后，洗凈瓶苗根部的培養基，用稀釋1 000倍的甲基硫菌靈或多菌靈浸泡組培苗根部，放置于通風陰涼處晾干水分至根系發白變軟，即可用于移栽。選擇碎樹皮、泥炭土、田園土3種基質為瓶苗栽培基質。

2結果與分析

2.1有機添加物對帶葉兜蘭原球莖誘導與分化的影響

在蘭科植物的無菌播種過程中，添加適量的不同有機添加物，通常會促進植物的生長與發育。試驗選用馬鈴薯、椰乳、香蕉、蘋果汁對帶葉兜蘭原球莖進行對比試驗。由圖5可知，在培養基中添加香蕉對帶葉兜蘭的種子萌發均具有顯著的促進作用，種子萌發率達95%，且均變綠；由圖6可知，添加馬鈴薯和香蕉的培養基中，原球莖的褐化率都較低，彼此間沒有顯著差別；由圖7可知，在添加了香蕉的培養基中，兜蘭原球莖分化率略大于其他3種添加物。可見， 香蕉對帶葉兜蘭原球莖誘導與分化具有促進作用，生長狀況最好。

2.2植物生長調節劑對芽增殖分化的作用

由圖8可知，不同濃度配比的6-BA和NAA對帶葉兜蘭芽的增殖率影響差異不顯著，增殖率均在40%～48%；但是，不同濃度培養基對芽分化率的影響差異顯著。由圖9可知，N4培養基在5個培養基激素配比對比組中，具有顯著促進分化作用。結果表明，5個不同濃度配比的培養基均具有增殖作用，但是增殖效果不明顯，不具有差異性，但是以 6-BA 1.0 mg/L和NAA 0.1 mg/L為濃度的培養基（N4）對分化具有明顯促進作用，分化率達48%，而N2培養基的芽分化率只有5%，說明高濃度的6-BA和低濃度的NAA利于其分化。為了更好地促進芽的增殖與分化，本試驗設計了不同有機添加物和6-BA及NAA濃度對芽褐化與分化的影響的處理（圖10、圖11）。由圖10可知，N5和N6培養基的褐化率最低，只有27%，處理中NAA濃度分別為0.1、0.01 mg/L，都是低濃度，說明低濃度的NAA利于芽的分化。

2.3植物生長調節物質對壯苗生根培養的影響

本試驗將分化出具有3～4張葉、高2 cm左右的小苗從培養瓶中取出，分別轉入不同激素及濃度配比的培養基上進行生根誘導。結果表明，誘導生根率達89%及其以上，但生根數量、生長長度及長勢之間有一定的差異。從表1可知，培養基B2的生根率最高，達到95%，但植株根系長勢弱，部分葉片偏黃；培養基B3中根系較細；培養基B1植株生長健壯，根系健壯，12周后長成 3～4條肉質根。所以，IBA所用濃度為0.2 mg/L作為生根誘導壯苗培養基最好。

2.4不同栽培基質對帶葉兜蘭成活率的影響

栽培時先將栽培基質和腐殖土混合放入栽培容器內，深度達容器的1/3高，將長出4～5張葉片、根長2 cm以上并具有3～4條根的兜蘭幼苗放入栽培容器內，用碎樹皮及苔蘚將苗的根頸部以下填實，讓容器和栽培基質緊密接觸。帶葉兜蘭根系最忌通氣不良和積水，盆栽和苗床上種植時，床下部須墊一層顆粒狀的小石塊，以利排水。每2～3周追施1次液體肥料，秋末氣溫降低后停止施肥。從表2可知，植株在田園土的適應過程較慢，碎樹皮栽培基質的移栽成活率最高，達97%，最適合帶葉兜蘭試管苗的生長（圖4）。

3結論與討論

兜蘭是蘭科植物中極具開發價值的重點保護種群之一[13]，以往的研究表明，帶葉兜蘭是萌發較為困難的種類之一，通過綜合各試驗階段，快速獲得大量帶葉兜蘭無菌試管苗，初步建立一套完整的帶葉兜蘭組織培養快速繁殖體系，為進一步開發利用帶葉兜蘭奠定基礎。

培養基的鹽分組成和濃度是影響兜蘭種子萌發的重要因素[14]，已報道的大部分兜蘭種類在高鹽濃度MS培養基上萌發均受到抑制，而在1/2、1/4的MS培養基上較為適宜。由于兜蘭種類的不同最終選用的培養基類型也就不同，本試驗中帶葉兜蘭在1/2MS培養基中萌發最佳，此結果和其他兜蘭屬植物相吻合。但在播種過程中，要注意種子的成熟度、無菌播種等因素，以免造成種子發芽率低。培養基中添加適當的有機物椰乳、香蕉、馬鈴薯和活性炭等均有利于蘭科植物種子的萌發和生長。一般認為，在培養基中加入適量的椰乳對種子萌發有促進作用[15]，添加馬鈴薯對兜蘭種子萌發也有較明顯的促進作用，且原球莖的顏色呈濃綠色，而香蕉泥對兜蘭種子的萌發反而有抑制作用[16]。

本試驗以成熟種子為外植體，研究以1/2MS為基本培養基，添加不同激素配比和有機物對帶葉兜蘭的種子萌發、原球莖及芽增殖、分化和生根誘導的影響，從中篩選出適合各個培養階段的培養基配方。結果表明：添加有機物香蕉的培養基對種子萌發有顯著促進作用；在原球莖繼代增殖階段，NAA和 6-BA組合對原球莖繼代增殖的作用顯著，通過NAA及6-BA濃度配比試驗，以6-BA與NAA濃度比為10 ∶1時效果最佳，即原球莖繼代增殖培養基為：1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+2.0%葡萄糖+0.5%瓊脂+005%活性炭；在芽增殖及分化階段，不同濃度配比的6-BA和NAA對芽增殖影響不明顯，但低濃度的NAA對芽的分化影響顯著；在生根誘導培養基階段，以1/2MS為主的基本培養基，IBA濃度為0.2 mg/L時生根效果最好，植株生長健壯，說明低濃度的IBA有利于根的生長。這與前期試驗中白花兜蘭種子無菌萌發及試管成苗研究中的生根誘導試驗結果一致[17]。在不同栽培基質對帶葉兜蘭移栽成活率的影響試驗中，碎樹皮的移栽成活率達97%，生根整齊，長勢良好。

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