雞疑似克雷伯氏桿菌病的診斷與藥敏試驗

胡曉苗 張丹俊 戴銀

摘要 [目的]診斷疑似患有克雷伯氏桿菌病的發(fā)病雞群。[方法]通過采取病雞肝臟和腦組織，接種于胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、兔血瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)出疑似克雷伯氏桿菌菌落，革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)該菌屬于革蘭氏陰性菌，將菌落進(jìn)行溶血試驗和生化試驗。[結(jié)果]初步判斷該菌為克雷伯氏桿菌。藥敏試驗中發(fā)現(xiàn)該菌對慶大霉素、妥布霉素、恩諾沙星、阿米卡星表現(xiàn)較敏感；對阿莫西林、卡那霉素、氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢曲松、多黏菌素、四環(huán)素有極強(qiáng)的耐藥性；對于紅霉素、新霉素的敏感性介于兩者之間。[結(jié)論]藥敏試驗為治療該菌提供了大致方向，同時提醒抗生素類藥物切不可濫用，以免產(chǎn)生耐藥性。

關(guān)鍵詞 克雷伯氏桿菌；生化試驗；藥敏

中圖分類號 S855 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）34-0092-03

Abstract [Objective] To diagnose the chickens suspected of having Klebsiella brucellosis. [Method] By using the liver and brain tissue of the diseased chicken， we inoculated in tryptone agar medium， MacConkeyagar medium， SS agar medium and rabbit blood agar medium to culture the suspected Klebsiella brucellosis colony. Gram stain found that the strain belonged to Gramnegative bacteria， the colony was subjected to hemolysis and biochemical tests. [Result] The results preliminarily reflected the suspected bacteria was Klebsiella brucellosis. The drug sensitivity test showed that the bacteria had strong drug resistance to amoxicillin， kanamycin，ampicillin，cefotaxime，ceftriaxone，polymyxin and tetracycline， more sensitivity to gentamicin， tobramycin， enrofloxacin， amikacin，and erythromycin， neomycin between them. [Conclusion] Drug sensitive test provides direction for treatment of the bacteria， but also reminds drugs must not be abused in order to avoid drug resistance.

Key words Klebsiella brucellosis；Biochemical tests；Drug sensitivity

雞克雷伯氏桿菌病是由克雷伯氏桿菌引起的一類以消化道或呼吸道疾病為主的傳染性疾病。該病可通過消化道感染家禽使其發(fā)病，導(dǎo)致畜禽發(fā)生化膿性炎癥，更甚者暴發(fā)敗血癥，引起小雞一側(cè)性或兩側(cè)性眼瞼腫脹與視力障礙，發(fā)病率為38%～46%，死亡率達(dá)32%。該病的發(fā)生和雞舍衛(wèi)生環(huán)境不良有很大關(guān)系。該研究病雞臨床表現(xiàn)主要為腿關(guān)節(jié)腫脹，通過對該雞的病樣進(jìn)行細(xì)菌分離與鑒定，結(jié)果初步判斷該病雞為克雷伯氏桿菌感染。

1 材料與方法

1.1 材料

組織病樣為病雞氣囊、肝臟和支氣管堵塞物等。培養(yǎng)基：胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基；SS瓊脂培養(yǎng)基；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基；兔血瓊脂培養(yǎng)基；三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基。主要試劑：革蘭氏染色試劑；藥敏紙片為慶大霉素等13種獸醫(yī)常用抗生素（購自杭州微生物試劑有限公司）；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管（購自杭州濱和生物科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 臨床癥狀。

病雞呆立，羽毛疏松零亂且毫無光澤感，排稀糞。眼睛流淚，低頭縮頸。眼部有黏液膿性分泌物流出，一側(cè)眼瞼腫脹，甚至完全閉眼。一側(cè)腿關(guān)節(jié)腫脹，癱瘓向一側(cè)。

1.2.2 病理剖解。

對病禽進(jìn)行剖解，可觀察到關(guān)節(jié)局部腫脹，剪開有可見關(guān)節(jié)化膿；氣囊炎渾濁；腸道出血，有膿性炎癥分泌物；肝臟有小白點樣物質(zhì)；支氣管有干酪樣堵塞物（圖1～3）。

1.2.3 細(xì)菌的分離。

無菌取自然病死的雞支氣管堵塞物接種于胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、兔血瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h后，察看細(xì)菌生長情況，再挑取單個有特征性的菌落接種于胰蛋白大豆肉湯液體培養(yǎng)基上進(jìn)行純培養(yǎng)，然后進(jìn)行涂片鏡檢和生化鑒定[1-2]。

1.2.4 溶血試驗。

用接種環(huán)挑取一環(huán)菌液在血平板上四區(qū)劃線后，放入恒溫箱37 ℃培養(yǎng)24 h后，察看其溶血現(xiàn)象。

1.2.5 生化試驗。

在超凈臺上接種細(xì)菌微量生化反應(yīng)管（乳糖、棉籽糖、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、阿拉伯糖、木糖、硫化氫、甘露醇、尿素、山梨醇、七葉苷、精氨酸雙水解酶、西蒙氏枸櫞酸鹽、氨基酸對照管），放進(jìn)恒溫箱中37 ℃培養(yǎng)6～48 h，觀察結(jié)果。

三糖鐵瓊脂試驗：用接種針挑取可疑菌落穿刺接種于該培養(yǎng)基底部，但不要刺穿并在斜面表面畫S形曲線涂布整個斜面，將該培養(yǎng)基放入恒溫箱中37 ℃培養(yǎng)18～24 h后，取出觀察結(jié)果。

1.2.5 藥敏試驗。

按常規(guī)圓紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗。取經(jīng)過驗證的克雷伯氏桿菌菌落，均勻涂布于該培養(yǎng)基上。用無菌鑷子將臨床上常用的13種藥敏紙片均勻貼于瓊脂表面并輕壓，使藥敏紙片能夠與瓊脂表面完全接觸，接觸后不要移動，放入恒溫箱37 ℃培養(yǎng)16～18 h后察看結(jié)果，并量出抑菌圈直徑，做好記錄[3-4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離結(jié)果

該菌在胰蛋白大豆肉湯瓊脂培養(yǎng)基、兔血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基以及SS瓊脂培養(yǎng)基上都可以生長。胰蛋白胨液體培養(yǎng)基中可見白色黏稠狀沉淀，搖晃后呈均勻渾濁。在胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，菌落呈灰白色圓粒狀凸起，邊緣光滑整齊、閃亮、濃厚、濕潤、黏稠，用接種環(huán)挑起易拉絲。在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上形成粉紅色黏稠菌落，有擴(kuò)散性，表面濕潤；在SS瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h后培養(yǎng)基變成粉紅色，形成粉紅色黏稠菌落。該菌經(jīng)過革蘭氏染色在顯微鏡下表現(xiàn)為紅色桿狀菌，屬于革蘭氏陰性菌。

2.2 溶血試驗結(jié)果

該菌株在兔血瓊脂培養(yǎng)皿中培養(yǎng)后觀察，菌落周圍可見完全通透的溶血環(huán)，為β溶血[5]。說明該菌有極強(qiáng)的致病性。

2.3 細(xì)菌生化試驗結(jié)果

觀察細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，可見反應(yīng)管顏色基本都發(fā)生變化（表1）。觀察培養(yǎng)后的三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基，可見其底部產(chǎn)生氣體，培養(yǎng)基的顏色由粉紅色變成黃色，沒有產(chǎn)生黑色物質(zhì)。說明該菌能分解乳糖類產(chǎn)酸，分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不產(chǎn)生H2S[6]。綜合上述各項結(jié)果初步判斷其為克雷伯氏桿菌。

2.4 藥敏試驗結(jié)果

根據(jù)藥物紙片周圍的抑菌圈直徑大小，判斷該菌對13種抗生素藥片的敏感程度，可分為敏感、中介和耐藥[7-8]，結(jié)果見表2。

3 結(jié)論與討論

克雷伯氏菌屬的細(xì)菌多感染免疫力較為低下的家禽，安徽省在我國中部，夏季高溫多雨，冬季天氣寒冷，季節(jié)交替時溫度變化快，這種季節(jié)變化使家禽應(yīng)激反應(yīng)劇烈，從而導(dǎo)致家禽免疫力下降，為各種動物源性微生物的生長提供了有利的條件，導(dǎo)致該病發(fā)生較為普遍[9]。

該次藥敏試驗結(jié)果表明，克雷伯氏桿菌對阿莫西林、卡那霉素、氨芐西林、四環(huán)素已產(chǎn)生高度耐藥性，這種現(xiàn)象的出現(xiàn)很有可能是因為養(yǎng)殖戶在飼養(yǎng)過程中濫用獸藥導(dǎo)致，故這類藥物已經(jīng)不適合臨床上用于克雷伯氏桿菌感染的經(jīng)驗性治療。克雷伯氏桿菌對慶大霉素、妥布霉素、恩諾沙星、阿米卡星比較敏感，臨床上可選用這類藥治療因克雷伯氏桿菌感染的疾病。另外，該菌對頭孢噻肟、頭孢曲松、多黏霉素、紅霉素、新霉素的敏感性一般，可選擇性適量用藥，以避免日后該菌對這類藥物也產(chǎn)生耐藥性。藥敏試驗結(jié)果提醒畜主對藥物切不可濫用，以免產(chǎn)生耐藥性，最好通過藥敏試驗來篩選最敏感藥物進(jìn)行治療。

參考文獻(xiàn)

[1] 黃新新，陸承平.遲緩愛德華菌的外膜蛋白圖譜及耐藥性分析[J].微生物學(xué)報，2001，41（5）：630-631.

[2] 陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].5版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2012：11.

[3] 崔治中.雞病[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2009：68-69.

[4] 李云章.獸醫(yī)專業(yè)畢業(yè)實習(xí)指導(dǎo)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2013：73-74.

[5] 翟小敏.A+OSA污泥減量工藝微生物特性研究[D].重慶：重慶大學(xué)，2012.

[6] 劉杰，趙滿倉.革蘭染色的實驗室質(zhì)量管理及進(jìn)展[J].解放軍醫(yī)藥雜志，2013，25（5）：83-86.

[7] 周忠坤.沙門氏菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)，2015（9）：94-95.

[8] 畢水蓮.奇異變形桿菌可移動耐藥基因島研究[D].廣州：華南理工大學(xué)，2011.

[9] 龍海波.小麥禾谷孢囊線蟲β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶和細(xì)胞壁擴(kuò)展蛋白基因的克隆及功能分析[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2012.