加味丹參飲對大鼠心肌缺血再灌注損傷SSAT活性的影響

任婷 饒春梅 成細(xì)華 楊勝輝 孫彥波 陳聰 彭霞 黃政德

摘要：目的 觀察加味丹參飲對SD大鼠心肌缺血再灌注損傷（IRI）模型精脒/精胺乙酰轉(zhuǎn)移酶（SSAT）/多胺通路的影響，探討其抗IRI的機(jī)制。方法 結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支30 min再灌注90 min建立大鼠心肌IRI模型。實驗大鼠隨機(jī)分為正常對照組、假手術(shù)組、模型組和加味丹參飲組，每組10只。TTC染色測定大鼠心肌梗死面積，ELISA檢測大鼠心肌組織SSAT含量，RT-PCR和Western blot分別檢測大鼠心肌組織SSAT mRNA和蛋白表達(dá)，HPLC檢測大鼠心肌組織多胺（腐胺、精脒、精胺）含量。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌梗死面積、SSAT含量增加，SSAT mRNA和蛋白表達(dá)升高，多胺含量降低（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，加味丹參飲組大鼠心肌梗死面積、SSAT含量減少，SSAT mRNA和蛋白表達(dá)降低，多胺含量升高（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 加味丹參飲可能通過調(diào)節(jié)SSAT/多胺通路，增加心肌細(xì)胞多胺含量，從而對大鼠心肌IRI發(fā)揮保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：加味丹參飲；心肌缺血再灌注損傷；多胺；精脒/精胺乙酰轉(zhuǎn)移酶；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.07.015

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）07-0062-04

Abstract： Objective To observe the effects of modified Danshen Decoction on spermidine/spermine acetyltransferase （SSAT） /polyamine pathways of SD rats with IRI； To investigate its protective mechanism. Methods The model of IRI was established by ligating left anterior descending coronary artery for 30 min followed by reperfusion for 90 min. The SD rats were randomly divided into the control group， sham-operation group， model group and modified Danshen Decoction group， with 10 rats in each group. The myocardial infarction size was measured by using TTC staining. The contents of SSAT were measured by ELISA. The SSAT mRNA and SSAT protein expression level were detected with real-time fluorescent quantitative PCR method and Western blot， respectively. The contents of polyamines （putrescine， spermidine， spermine） in cardiac tissue were detected by HPLC. Results Compared with sham-operation group， the myocardial infarction size， the SSAT content， the SSAT mRNA and SSAT protein expression levels of model group increased significantly， the contents of polyamines decreased significantly， with statistical significance （P<0.01）； Compared with model group， the myocardial infarction size of modified Danshen Decoction group was significantly reduced， while the SSAT content and SSAT mRNA and protein expression level decreased significantly， the contents of polyamines increased， with statistical significance （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Modified Danshen Decoction can adjust the SSAT polyamine pathways and increase polyamine content in cardiomyocytes， and thus play a role of protection of myocardial ischemia-reperfusion injury.

Key words： modified Danshen Decoction； myocardial ischemia/reperfusion injury； polyamines； spermidine/ spermine acetyltransferase； rats

近年來，隨著血運重建技術(shù)的廣泛開展，心肌缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）機(jī)制及心肌保護(hù)的研究成為倍受重視的課題，但I(xiàn)RI所涉及機(jī)制復(fù)雜，目前尚未清楚，臨床上仍缺乏針對心肌保護(hù)的藥物。多胺（腐胺、精脒和精胺）是存在于真核細(xì)胞且含高密度正電荷的一類有機(jī)小分子，廣泛參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞生長與分化、細(xì)胞程序性凋亡及基因表達(dá)調(diào)控等重要的生理病理過程[1]。研究發(fā)現(xiàn)，多胺系統(tǒng)在IRI發(fā)揮重要作用[2]。在IRI時，多胺代謝失衡，多胺分解代謝的限速酶——精脒/精胺乙酰轉(zhuǎn)移酶（spermidine/spermine N1-acetyltransferase，SSAT）表達(dá)改變，腐胺生成增多而精胺、精脒減少[3-4]，均與IRI密切相關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，益氣活血中藥復(fù)方加味丹參飲對防治心肌IRI有重要作用[5-7]。本研究在此基礎(chǔ)上，采用SD大鼠制作IRI模型，觀察加味丹參飲預(yù)處理對大鼠IRI后SSAT表達(dá)和活性及多胺含量變化的影響，從SSAT/多胺分解代謝調(diào)控角度進(jìn)一步探討該方抗心肌IRI機(jī)制，為防治心肌IRI尋找新的靶點和藥物。

1 實驗材料

1.1 動物

清潔級SD大鼠100只，雌雄各半，8～10周齡，體質(zhì)量220～300 g，湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物許可證號SYXK（湘）2013-0005。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實驗動物中心，溫度18～25 ℃、濕度50%～60%，正常光照，自由攝食飲水。

1.2 藥物

加味丹參飲（丹參20 g、檀香6 g、赤芍10 g、川芎6 g、當(dāng)歸6 g、紅花6 g、生地黃12 g等），飲片均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，藥物混勻，浸泡30 min，水煎2次（檀香后下），合并煎液，過濾，濃縮至1 g原藥材/mL。

1.3 主要試劑與儀器

腐胺、精脒、精胺（美國Sigma公司），ELISA試劑盒（Clod-Clone Corp公司），RevertAid? H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas公司），Trizol試劑（Invitrogen公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Taka-Ra公司），SYBR GreenPCR Master Mix（美國ABI），引物（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），BCA蛋白定量試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），兔抗大鼠SAT1一抗（Bioss公司），β-actin一抗（Santa cruz公司），HRP耦聯(lián)山羊抗兔IgG（美國Sigma公司）。小動物呼吸機(jī)（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗儀器廠，DH-8型），十六導(dǎo)生理記錄儀（Biopac公司，MPl50型），RT-PCR儀（美國ABI公司，7900型），水平電泳槽（北京君意東方儀器公司，JY-SPC），電泳儀（北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心，DG-Ⅲ），紫外凝膠檢測和成像系統(tǒng)（BIO-RAD，美國），高速冷凍離心機(jī)（美國Sigma公司）。

2 實驗方法

2.1 造模

參照文獻(xiàn)[3]方法進(jìn)行造模。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，切開氣管，連接小動物呼吸機(jī)行人工通氣，于第3、4肋間開胸暴露心臟，于冠狀動脈左心室前降支離左心耳下緣約0.15 cm處繞左心室支穿線結(jié)扎，缺血30 min后剪開結(jié)扎線，再灌注90 min，造成心肌IRI。假手術(shù)組冠狀動脈穿線不結(jié)扎。術(shù)中連續(xù)監(jiān)視心電圖Ⅱ?qū)?lián)的變化，以ST段抬高，T波高聳、倒置或左心室變?yōu)樯n白色為心肌缺血結(jié)扎成功（心肌缺血）的標(biāo)志，剪開結(jié)扎線后ST段回落50%以上、高聳T波下降或左心室由蒼白變?yōu)榘导t色表示再灌注成功。

2.2 分組與給藥

實驗大鼠隨機(jī)分為正常對照組、假手術(shù)組、模型組和加味丹參飲組，每組10只。加味丹參飲組每日給予加味丹參飲7.74 g/kg灌胃[8]（按人和動物間體表面積等效劑量換算），于末次灌胃1 h后建立IRI模型。正常對照組、假手術(shù)組和模型組均予等量生理鹽水灌胃。灌胃體積均為7.74 mL/kg，每日2次，連續(xù)14 d。

2.3 指標(biāo)檢測

2.3.1 TTC染色測定心肌組織梗死面積 再灌注結(jié)束后取下心臟，剪除左心室以外心肌組織，置于-20 ℃冰箱冰凍10 min后切片，每片厚約1 mm，放入1%TTC PBS（pH 7.4）中，37 ℃水浴箱中孵育20 min，振蕩染色液，使之與心肌充分接觸。終止染色后將切片置于10%甲醛溶液中固定過夜。數(shù)碼相機(jī)拍照，存活心肌呈磚紅色，梗死區(qū)呈灰白色。應(yīng)用Imagemaster VDS圖像分析儀分析心肌梗死面積占心肌總面積的百分比。心肌梗死面積率（%）=所有切片梗死面積之和÷心肌總面積之和×100%。

2.3.2 ELISA檢測心肌組織精脒/精胺乙酰轉(zhuǎn)移酶含量 再灌注結(jié)束后取大鼠左心室肌組織，用預(yù)冷PBS沖洗后加入5 mL PBS，于玻璃勻漿器冰上充分研磨，勻漿液5000 r/min離心5 min，取上清液，按ELISA試劑盒說明書測定SSAT含量。

2.3.3 RT-PCR檢測心肌組織精脒/精胺乙酰轉(zhuǎn)移酶mRNA表達(dá) 再灌注結(jié)束后取大鼠左心室組織，參照Trizol試劑盒方法提取總RNA，取2 μL RNA稀釋后，在紫外分光光度儀上測定樣品RNA純度及濃度。以總RNA為模板，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，取上述所得cDNA按25 μL體系，RT-PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，循環(huán)40次。反應(yīng)結(jié)束后讀取Ct值，通過融解曲線監(jiān)測各樣本PCR反應(yīng)的特異性，以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt給藥組-ΔCt對照組，差別倍數(shù)=2-ΔΔCt，其中正常對照組數(shù)值設(shè)為1。PCR引物序列SSAT正義5'-AAAGGCACTGTCTTGCCACT-3'，反義5'-GTGGCTGGACGGATCTTAAA-3'，產(chǎn)物長度231 bp；β-actin正義5'-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3'，反義5'-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3'，產(chǎn)物長度228 bp。

2.3.4 Western blot檢測心肌組織精脒/精胺乙酰轉(zhuǎn)移酶蛋白表達(dá) 取大鼠左心室心肌組織，加入預(yù)冷全細(xì)胞裂解液，于液氮內(nèi)研磨，將勻漿冰上處理30 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，提取胞漿總蛋白，BCA法測定上清液蛋白含量，置于-80 ℃?zhèn)溆谩Ｈ“麧{蛋白，加入上樣緩沖液，于100 ℃水中煮5 min，每孔40 μg蛋白上樣，經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，取膜后置于含5%脫脂奶粉封閉液中封閉1 h，加SSAT或β-actin一抗（按1∶500稀釋于一抗稀釋液中），4 ℃孵育過夜；TBST洗膜后加HRP標(biāo)記羊抗兔IgG室溫孵育1 h；TBST洗膜后顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，計算條帶吸光度值。SSAT蛋白表達(dá)以其與β-actin內(nèi)參蛋白吸光度比值表示。

2.3.5 HPLC測定心肌組織多胺含量 參照文獻(xiàn)[9]方法。再灌注后取左心室組織約150 mg，加0.3 mmol/L冷高氯酸，冰水浴中制成勻漿，3500 r/min離心10 min，取上清液400 μL，加入內(nèi)標(biāo)（1，6-己二胺）10 nmol混勻，加2 mol/L NaOH 2 mL、苯甲酰氯 10 μL，振蕩5 min，40 ℃水浴30 min后，加氯仿2 mL，振蕩2 min，2000 r/min離心10 min，取1.5 mL氯仿層，加2 mL流動相，振蕩，離心，再吸取氯仿層，加熱揮干，殘余物溶于300 μL甲醇，取10 μL，HPLC分析多胺。固定相為Hypersil ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-雙蒸水（V∶V，65∶35），柱溫 35 ℃，流速0.4 mL/min，紫外檢測波長229 nm，AUFS 0.04。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以—x±s表示，組間比較采用方差分析，方差不齊采用非參數(shù)檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 加味丹參飲對模型大鼠缺血再灌注心肌梗死面積的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠心肌梗死面積率顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，加味丹參飲組大鼠心肌梗死面積率顯著降低（P<0.01）。結(jié)果見表1。

4.2 加味丹參飲對模型大鼠心肌組織精脒/精胺乙酰轉(zhuǎn)移酶含量的影響

與正常對照組比較，假手術(shù)組大鼠心肌組織SSAT含量無明顯變化，模型組大鼠心肌組織SSAT含量顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，加味丹參飲組大鼠心肌組織SSAT含量顯著降低（P<0.01）。結(jié)果見表2。

4.3 加味丹參飲對模型大鼠心肌組織精脒/精胺乙酰轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的影響

與正常對照組比較，假手術(shù)組大鼠心肌組織SSAT mRNA和蛋白表達(dá)無明顯差異，模型組大鼠心肌組織SSAT mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，加味丹參飲組SSAT mRNA表達(dá)顯著降低（P<0.01）。結(jié)果見表3、圖1。

4.4 加味丹參飲對模型大鼠心肌組織多胺含量的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠心肌組織精胺合成減少（P<0.05），腐胺合成增加（P<0.01），精脒變化較小，總多胺池減少（P<0.05）；與模型組比較，加味丹參飲組腐胺合成減少（P<0.05），精胺和總多胺池含量增加（P<0.05）。結(jié)果見表4。

5 討論

多胺具有眾多生理功能，并在許多病理過程中發(fā)揮作用，多胺能抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)小鼠血清中炎癥介質(zhì)的釋放；在心肌缺血和心肌肥大的細(xì)胞凋亡中均發(fā)揮重要作用。目前已知腫瘤發(fā)生、應(yīng)激、心肌肥大、心肌重構(gòu)、腦缺血等許多病理事件的發(fā)生與細(xì)胞內(nèi)多胺代謝失衡有關(guān)，心肌IRI時多胺代謝失衡，鳥氨酸脫羧酶及SSAT的活性改變[10]。SSAT為多胺代謝限速酶，SSAT催化精胺逆轉(zhuǎn)化為精脒及精脒逆轉(zhuǎn)化為腐胺的過程。SSAT使腐胺生成增多而精胺、精脒減少，將導(dǎo)致繼發(fā)性的心肌損傷。SSAT過表達(dá)老鼠表現(xiàn)出多胺降解增加，超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和CYP450表達(dá)下降，導(dǎo)致過氧化氫生成增加[11]，可見影響SSAT活性則可影響多胺含量變化，從而對心肌組織IRI產(chǎn)生影響。調(diào)控SSAT表達(dá)可能對于IRI具有潛在的治療價值。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注時SSAT含量顯著增加，SSAT mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高。同時發(fā)現(xiàn)SSAT表達(dá)升高后，腐胺含量增加和精脒、精胺、總多胺池含量減少，表明心肌組織IRI可能誘導(dǎo)多胺代謝過程產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，多胺分解代謝酶SSAT表達(dá)升高。SSAT腐胺生成增多而精胺、精脒減少，將導(dǎo)致繼發(fā)性的心肌損傷[12]。

我們前期實驗結(jié)果顯示，加味丹參飲對IRI心肌有明顯的延遲保護(hù)作用[5-7]。本研究結(jié)果顯示，加味丹參飲預(yù)處理大鼠心肌IRI模型后，SSAT mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低，SSAT含量顯著減少，提示加味丹參飲可能通過調(diào)節(jié)SSAT/多胺分解代謝，減少IRI后腐胺生成，從而發(fā)揮抗IRI保護(hù)作用，但具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2016-09-29）

（修回日期：2016-10-31；編輯：華強(qiáng)）