山核桃仁多酚提取工藝及其抗氧化活性研究

俞憬　陳冠林　楊璐齊

摘要：以山核桃（Carya cathayensis）仁為材料，采用單因素試驗和正交試驗輔助超聲波提取其中的多酚，確定多酚提取的最佳工藝，采用FRAP、DPPH和ABTS 3種方法測定了山核桃仁多酚的抗氧化能力并用Folin-Ciocalteu法測定其總酚含量。結果表明，多酚提取的最佳工藝組合為料液比1∶50（g∶mL），乙醇體積分數30%，超聲時間20 min，提取溫度35 ℃。FRAP、DPPH和ABTS法測得山核桃仁多酚的抗氧化活性分別為108.94、184.71和175.92 μmol Trolox/g。山核桃仁多酚是較好的抗氧化劑。

關鍵詞：山核桃（Carya cathayensis）仁；多酚；抗氧化性

中圖分類號：S664.1；TS209 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）11-2109-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.11.029

Abstract： Using hickory（Carya cathayensis） nut kernelas material，ultrasound as a auxiliary extraction method， the single-factor and orthogonal array design methods were used to determine the optimum technologicalconditions for extraction of phenolic compounds. FRAP， DPPH and ABTS methods were used to determine the antioxidant activities of polyphenols in hickory nut kernels， and Folin-Ciocaheu method was used to determine the total phenolic contents. The results indicated that the optimal technological conditions for extracting polyphenols were as follows：the ratio of material to solvent was 1∶50（g∶mL）， volume fraction of ethanol was 30%， extraction time was 20 min， and extraction temperature was 35 ℃. The antioxidant activities of polyphenols in hickory nut kernel measured with FRAP， DPPH and ABTS method were 108.94， 184.71 and 175.92 μmol Trolox/g， respectively. And polyphenols in hickory nut kernel were good antioxidants.

Key words： hickory（Carya cathayensis） nut kernel； polyphenol； antioxidant activity

山核桃（Carya cathayensis）為胡桃科（Juglandaceae）山核桃屬（Carya Mutt）植物，是重要的栽培樹種之一[1]。山核桃屬約有18個種，3個亞種，主要分布在亞洲的東南部以及北美的東部，中國浙江、云南、貴州、湖南、大別山等地分布有5個種[2]。中國核桃資源非常豐富，2010年核桃年產量為128萬t，面積和產量均為世界第一[3]。研究發現，核桃仁中蛋白質的含量為9%，含有17種氨基酸，其中7種為人體必需氨基酸。此外，核桃還富含多種不飽和脂肪酸和礦物元素等[4]，具有極高的營養價值以及研究前景。已有學者對核桃仁進行了相關的研究[5-8]，但對山核桃仁多酚提取條件優化的研究較少，對山核桃仁多酚的抗氧化性也缺少系統的研究。因此，本研究對山核桃仁中多酚的提取條件進行優化，采用超高效液相色譜（UPLC）測定其成分，并系統地研究其抗氧化活性，為進一步開發利用該資源提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料：山核桃購于廣東省佛山市市場，剝取核桃仁后干燥粉碎。

試劑：乙醇、Trolox（水溶性維生素E）、TPTZ（三吡啶三吖嗪）、FeCl3、HCl溶液、乙酸鈉緩沖液、福林-酚試劑、乙醇溶液、DPPH·、過硫酸鉀、沒食子酸、ABTS+·。

儀器：UV-9600型紫外/可見分光光度計（北京瑞利分析儀器有限公司）、LEO-150S型超聲清洗儀。

1.2 方法

1.2.1 山核桃仁多酚提取條件的確定 采用乙醇提取核桃仁中的多酚，中間輔助超聲波以提高其含量，并對所得的多酚含量進行測定。通過單因素試驗確定各因素的最佳提取條件，在單因素試驗的基礎上進行4因素3水平正交試驗，對影響核桃仁多酚提取效果的各因素進行優化。

1.2.2 DPPH法測定抗氧化活性 取0.1 mL待測樣品，加入0.06 mmol/L DPPH·80%乙醇溶液3.9 mL，振蕩15 s，放置暗處反應2 h后，于515 nm處測定其吸光度，按公式計算清除率。清除率=（A對照-A樣品）/A對照×100%。以3.9 mL DPPH·+0.1 mL 80%乙醇作對照，空白為80%乙醇，以Trolox溶液為標樣繪制標準曲線，樣品的抗氧化活性用Trolox當量表示，單位為μmol Trolox/g[9]。

1.2.3 FRAP法測定抗氧化活性 FRAP試劑由10 mmol/L的TPTZ（溶于40 mmol/L鹽酸）、20 mmol/L的FeCl3、300 mmol/L的乙酸鈉緩沖液（pH 3.6）以 1∶1∶10（V/V/V）的比例混合而成。取100 μL待測樣品，加入3 mL FRAP試劑中充分混合，反應120 min后于593 nm處測定其吸光度。以Trolox溶液為標樣繪制標準曲線，樣品的抗氧化活性用μmol Trolox/g表示[10，11]。

1.2.4 ABTS法測定抗氧化活性 將7 mmol/L的ABTS（用pH 4.5、20 mmol/L的乙酸鈉配制）和2.45 mmol/L的過硫酸鉀等體積混合，室溫下避光反應12～16 h，形成ABTS+·儲備液。使用前用20 mmol/L乙酸鈉（pH 4.5）將ABTS+·儲備液稀釋為工作液，使其在734 nm處吸光度為0.700±0.002。取100 μL待測樣品，加入3 mL ABTS+·工作液，振蕩30 s，室溫下反應1 h后，在734 nm處測定其吸光度。以20 mmol/L乙酸鈉（pH 4.5）為空白，ABTS+·為對照，以Trolox溶液為標樣繪制標準曲線，樣品的抗氧化活性用TEAC表示[10]，單位為μmol Trolox/g。

1.2.5 總酚含量的測定 取0.50 mL待測樣品，加入2.50 mL 1∶10稀釋的福林-酚試劑中，反應4 min后，加入2.00 mL 75 g/L的Na2CO3溶液，置室溫下反應120 min，于765 nm處測定其吸光度。結果以沒食子酸當量表示，單位為mg GAE/g[12，13]。

1.2.6 UPLC色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLCR HSS T3（50 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱溫30 ℃，進樣量1 μL，流速0.3 mL/min，流動相為乙腈-甲酸水溶液（0.2%甲酸），梯度洗脫（洗脫程序：0 min，7%乙腈；4 min，16%乙腈；6 min，40%乙腈；7 min，7%乙腈；10 min，7%乙腈）[14]，結果以μg/g DW表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料液比對山核桃仁多酚提取的影響 固定乙醇體積分數為40%，超聲時間10 min，提取溫度30 ℃，分別以不同料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，g∶mL，下同）提取山核桃仁多酚。由圖1可知，料液比為1∶40時山核桃仁多酚的含量最低，料液比為1∶50時山核桃仁多酚的含量最高。因此，確定適宜的料液比為1∶50。

2.1.2 乙醇體積分數對山核桃仁多酚提取的影響 固定料液比為1∶50，提取時間10 min，提取溫度30 ℃，分別以不同體積分數（10%、20%、30%、40%、50%）的乙醇提取山核桃仁多酚。由圖2可知，乙醇體積分數對山核桃仁多酚提取含量的影響呈波浪形，乙醇體積分數在50%時提取含量最高，再增大乙醇體積分數會增加生產成本。因此，確定適宜的乙醇體積分數為50%。

2.1.3 超聲時間 固定料液比為1∶50，50%乙醇，提取溫度30 ℃，分別以不同的超聲時間（10、15、20、25、30 min）提取山核桃仁多酚。從圖3可以看出，超聲時間對山核桃仁多酚的提取有明顯影響，超聲時間為20 min時，山核桃仁多酚含量最高，因此確定20 min為最佳的超聲時間。

2.1.4 提取溫度 固定料液比為1∶50，提取時間20 min，50%乙醇，分別以不同的提取溫度（30、35、40、45、50 ℃）提取山核桃仁多酚。從圖4可以看出，35 ℃時核山桃仁多酚含量最高，35 ℃后提取含量呈下降趨勢，因此確定35 ℃為最佳的提取溫度。

2.2 山核桃多酚提取的正交試驗

根據山核桃仁多酚提取的單因素試驗結果，確定料液比、乙醇體積分數、超聲時間和提取溫度為4個主要的影響因素，每個因素選取3個水平（表1），然后設計L9（34）正交試驗，試驗結果見表2。

由表2可知，影響山核桃中多酚提取效果的因素大小順序為D>C>A>B，即提取溫度>超聲時間>料液比>乙醇體積分數，說明提取溫度對多酚的提取效果影響最大，其次是超聲時間，再次是料液比，而乙醇體積分數對多酚的提取效果影響最小。4個因素的最佳組合方案為A2B1C2D2，即1∶50的料液比，30%的乙醇溶液，超聲時間20 min，提取溫度35 ℃，在該條件下從1 g山核桃仁中可提取得到21.88 mg GAE/g多酚。

2.3 UPLC分析結果

山核桃仁多酚包括酚酸類和黃酮類兩大部分，其色譜見圖5。采用UPLC法測定得到每克山核桃仁中多酚物質的含量見表3。由表3可知，在現有的標準中，山核桃仁中槲皮苷的含量最高，達到3 221.31 μg/g（DW）；其次是蘆丁，其含量為299.51 μg/g（DW）；香草酸和表兒茶素的含量較低，分別為166.00、130.37 μg/g（DW）。兒茶素具有多種生物活性功能，包括抗菌、抗惡性細胞增生、抗炎、減少內臟脂肪以及降低血清膽固醇和甘油三酯水平[15]。研究發現，蘆丁也具有多種生物活性，包括降糖、抗炎、抗癌、抗哮喘以及保護神經的作用[16]。核桃多酚對低密度脂蛋白膽固醇的氧化有很好的抑制作用[17]。沒食子酸、兒茶素、表兒茶素等對低密度脂蛋白膽固醇的氧化有較好的抑制作用[18]。酚類化合物對低密度脂蛋白膽固醇氧化的抑制作用可能是酚類對自由基的清除或者與金屬離子螯合有關[19]。

2.4 抗氧化活性試驗

采用FRAP、DPPH和ABTS法測定山核桃仁多酚的抗氧化性，結果見圖6。由圖6可知，FRAP、DPPH和ABTS法測得山核桃仁多酚的抗氧化活性分別為108.94、184.71和175.92 μmol Trolox/g，與山核桃殼多酚的抗氧化活性相比，山核桃仁多酚的FRAP、DPPH和ABTS抗氧化活性比核桃殼多酚強[20]。研究發現，總酚含量與其抗氧化能力相關，總酚含量高，則其抗氧化能力強，酚類對預防氧化應激相關疾病有重要的作用[14]。總酚與FRAP、DPPH以及ABTS的相關性較強；沒食子酸與FRAP、DPPH以及ABTS的相關性較強；異槲皮苷與FRAP的相關性較強；阿魏酸與ABTS的相關性較強[21]。

3 小結

通過單因素和正交試驗得出山核桃仁多酚提取的優化工藝條件為料液比1∶50，乙醇體積分數30%，超聲20 min，提取溫度35 ℃。山核桃仁中槲皮苷的含量最高，達到3221.31 μg/g（DW）；其次是蘆丁，其含量為299.51 μg/g（DW）。FRAP、DPPH和ABTS 3種抗氧化活性測定方法表明，山核桃仁多酚是很好的抗氧化劑。

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