密度梯度離心法和紅細胞裂解法對小鼠外周血淋巴細胞表面分子表達的影響

周揚++鐘銳華++唐利波

[摘要] 目的 比較密度梯度離心法和全血紅細胞裂解法對小鼠外周血淋巴細胞表面分子表達的影響。方法 采用流式細胞術檢測密度梯度離心法和全血紅細胞裂解法獲得的小鼠外周血存活淋巴細胞比例以及表型分子（CD3、CD4、CD8、CD19和CXCR5）的頻數。 結果 密度梯度離心法獲得的小鼠外周血存活淋巴細胞比例較全血紅細胞裂解法獲得的存活淋巴細胞顯著升高（92.70% vs 85.90%，P<0.05）。與密度梯度離心法相比，全血紅細胞裂解法可使外周血淋巴細胞中CD3、CD4和CD8表達顯著下降（60.10% vs 35.90%，P<0.05；42.90% vs 20.30%，P<0.05；24.60% vs 14.80%，P<0.05），而CD19和CXCR5表達則顯著升高（12.80% vs 35.30%，P<0.05；15.00% vs 35.10%，P<0.05）。結論 密度梯度離心法獲得的小鼠外周血淋巴細胞活力強且表型穩定，可作為分離此類細胞的優選方法。

[關鍵詞] 流式細胞術；小鼠外周血；淋巴細胞；密度梯度離心法；全血紅細胞裂解法

[中圖分類號] R446 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）05（b）-0031-03

[Abstract] Objective To compare the effect of density gradient centrifugation and red blood cell lysis method on the expression of peripheral blood lymphocytes surface molecules in rats. Methods The frequency of survival lymphocyte ratio and surface molecules （CD3， CD4， CD8， CD19 and CXCR5） in rats were tested by the density gradient centrifugation and red blood cell lysis method. Results The peripheral blood survival lymphocytes ratio tested by the density gradient centrifugation was obviously increased compared with that of red blood cell lysis method （92.70% vs 85.90%，P<0.05）， and the red blood cell lysis method could make the CD3， CD4 and CD8 in the peripheral blood lymphocytes obviously decreased compared with that of density gradient centrifugation （60.10% vs 35.90%， P<0.05； 42.90% vs 20.30%，P<0.05；24.60% vs 14.80%， P<0.05）， but the expressions of CD19 and CXCR5 obviously increased （12.80% vs 35.30%， P<0.05； 15.00% vs 35.10%， P<0.05）. Conclusion The vigor of peripheral blood lymphocytes of rats obtained by the density gradient centrifugation is strong with steady phenotype， which can be used as the preferred method in isolating this type of cells.

[Key words] Flow cytometry； Peripheral blood of rats； Lymphocytes； Density gradient centrifugation； Red blood cell lysis method

小鼠全血樣品制備的質量可影響流式細胞術免疫檢測的結果，目前在臨床和基礎實驗研究中廣泛應用商品化紅細胞裂解液以達到去除紅細胞的效果。雖然既往報道商品化紅細胞裂解液對小鼠淋巴細胞表面分子表達無影響[1]，但人群中研究顯示紅細胞裂解液會影響造血干細胞CD34表達[2]。該研究采用密度梯度離心法和全血紅細胞裂解法制備小鼠外周血淋巴細胞，通過流式細胞術檢測這兩種方法獲得的淋巴細胞的活力以及表面分子表達頻數，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

小鼠淋巴細胞分離液（貨號：LTS1092），Live/Dead（貨號：L10119），BD Pharm LyseTM溶液（10x，貨號：555899）、抗鼠CD3（貨號：555275）、抗鼠CD4（貨號：553651）、抗鼠CD8-PECY7（貨號：552877）、抗鼠CD19（貨號：552854）、抗鼠 CXCR5（貨號：560615）。

1.2 實驗動物

野生型C57 BL/6小鼠（6～8周齡）15只。

1.3 制備小鼠淋巴細胞懸液

小鼠眼眶靜脈叢取300 μL肝素鈉抗凝血，200 μL用于密度梯度離心法制備細胞懸液，100 μL用紅細胞裂解液制備細胞懸液。

1.4 細胞活力檢測

取100 μL細胞懸液恒溫孵箱培養3 d后，采用Live/Dead染色，流式檢測細胞活力。

1.5 細胞免疫表型檢測

取1×106 個細胞采用Live/Dead染色后，加入CD3、CD4、CD8、CD19和CXCR5流式抗體，避光孵育30 min，1 mL PBS洗滌后棄上清，100 uL PBS重懸，流式檢測。

1.6 統計方法

采用SPSS 20.0統計學軟件進行處理。組間比較采用兩獨立樣本非參數檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 密度梯度離心法獲得的淋巴細胞活力較好。

采用AIM-V培養外周血免疫細胞3 d，標記Live/Dead后采用流式檢測。結果表明，與密度梯度離心獲得的淋巴細胞相比，全血紅細胞裂解獲得的淋巴細胞活力顯著降低（85.90% vs 92.70%，P<0.05），可見紅細胞裂解法獲得的淋巴細胞活力欠佳，不適宜于體外長期培養，見圖1。

2.2 淋巴細胞表面分子表達頻數的檢測

密度梯度離心法和全血紅細胞裂解法獲得的淋巴細胞標記CD3、CD4、CD8、CD19以及CXCR5，流式細胞術檢測結果顯示，與密度梯度離心法相比較，全血紅細胞裂解法獲得的外周血淋巴細胞CD3、CD4和CD8表達頻數顯著下降（60.10% vs 35.90%，P<0.05；42.90% vs 20.30%，P<0.05；24.60% vs 14.80%，P<0.05；圖2），而CD19和CXCR5表達頻數則顯著升高（12.80% vs 35.30%，P<0.05；15.00% vs 35.10%，P<0.05；見圖2）。

3 討論

動態檢測小鼠外周血淋巴細胞的表型和功能對于了解小鼠體內免疫應答狀況具有重要參考價值。小鼠外周血淋巴細胞的檢測結果可受抗體類型、圈門策略以及熒光素等因素的影響[3-4]，另外，獲得淋巴細胞的分離方法也可對檢測結果產生直接影響[5-6]。

細胞亞群的功能檢測對于了解體內免疫狀態和探討機制有著重要意義，而細胞活力是檢測的先決條件[7-8]。該研究結果顯示紅細胞裂解液所獲得的細胞培養3 d后活細胞比例雖然可維持在80%左右，但較密度梯度離心法所得細胞的活力已明顯下降。可見，紅細胞裂解液會導致淋巴細胞活力下降，此影響在細胞長期培養時更加明顯。紅細胞裂解液除了影響淋巴細胞活力，重要的是其會導致淋巴細胞亞群比例偏倚，表現為T細胞亞群比例下降而B細胞亞群比例升高。該研究中使用紅細胞裂解液獲得的小鼠外周血淋巴細胞CD3、CD4和CD8分子表達中位數分別為35.90%、20.30%以及14.80%，和既往研究相一致[1]。雖然此試劑不含有固定劑成分，但其在裂解紅細胞同時可能也會干擾淋巴細胞表面分子的表達，因此細胞亞群表達比例失調將會對免疫分析產生不可忽視的影響。相對而言，小鼠淋巴細胞分離液獲取的外周血淋巴細胞是應用密度梯度離心法，此方法獲得的淋巴細胞表面抗原表達受外源性物質干擾較小，更能真實反映各個細胞亞群的特點。

綜上所述，該研究認為小鼠外周血淋巴細胞抗原表達的檢測應慎重選擇使用紅細胞裂解液。密度梯度離心法獲得的淋巴細胞長時間體外培養仍具有較強活力且各細胞亞群表型穩定，密度梯度離心法可作為小鼠外周血淋巴細胞分離的優選方法應用于實驗研究。

[參考文獻]

[1] 張文杰，馮巖，王智華，等.肺炎患兒外周血T淋巴細胞表型分析[J].河北醫藥，2014，36（19）：2967-2969.

[2] 章梁君，鐘錦莎，鐘輝秀，等.惡性腫瘤患者外周血淋巴細胞免疫表型檢測的臨床意義[J].國際檢驗醫學雜志，2015，36（24）：3565-3567.

[3] 徐志娟，盛立霞，歐陽桂芳，等.臍血間充質干細胞抑制外周血淋巴細胞增殖的作用[J].細胞與分子免疫學雜志，2014， 30（9）：968-971.

[4] 張俊紅，王文革，耿揚，等.支原體肺炎兒童外周血CD4+CD25+調節性T細胞水平的變化及維生素A的調節作用[J].中國醫藥，2015，10（1）：61-65.

[5] 張江勃，付蓉，王一浩，等.免疫相關性全血細胞減少癥患者外周血淋巴細胞端粒長度研究[J].中華血液學雜志，2014， 35（7）：605-608.

[6] 任敏，單哲，許聯紅，等.免疫性血小板減少癥患者協同刺激分子的表達及意義[J].中國醫學創新，2014，11（34）：29-31.

[7] 孔慶暖，王麗娜，韓增磊，等.液基薄層制片技術制作外周血淋巴細胞涂片方法學的建立及免疫組化染色應用[J].中國醫藥導報，2015，12（18）：23-25，29.

[8] 吳姍姍，嚴峰，鄧玉玲，等.小細胞和非小細胞肺癌晚期患者 CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞亞群的差異[J].中國免疫學雜志，2015，31（1）：114-116，121.

（收稿日期：2017-02-09）