樟樹幼苗根系分泌物中有機酸對PAHs脅迫的響應

張力+劉益君+陳毅

摘要：根據當地PAHs自然沉降成分特點，設置了4個PAHs混合物濃度梯度：C（總PAHs含量為0 mg/kg），L（總PAHs含量為1.5 mg/kg）、M（總PAHs含量為7.5 mg/kg）和H（總PAHs含量為75 mg/kg），對樟樹幼苗進行脅迫，提取培養基中根系分泌物，利用MALDI TOF/TOF測定了其中低分子有機酸，以探求根系分泌物中有機酸的變化規律。研究結果顯示：乙酸、丙二酸分子量相對較低的有機酸含量隨著PAHs脅迫程度的增加一直表現出上升趨勢；對羥基苯甲酸、香草酸、沒食子酸和檸檬酸分子量相對較高的有機酸含量隨著PAHs脅迫程度的增加在M處理下達到峰值，但隨著脅迫程度的繼續升高在H處理下迅速降低；羥基苯甲酸、香草酸、沒食子酸含量與植物根系活性和TOC、TN變化一致可以作為說明根系生長狀況的指標。

關鍵詞：根系分泌物；多環芳烴；有機酸；飛行時間質譜

中圖分類號：S731.2

文獻標識碼：A 文章編號：16749944（2017）11007404

1 引言

環芳烴（PAHs）排放量隨著能源消耗增加而迅速增長，由于其性質穩定，自然環境中降解周期長，因此在表層土壤積累量不斷增加[1]，并通過生態系統物質循環最終進入人體體內，對人類健康產生危害[2～5]。根系分泌物（root exudate）在微生物降解污染物中可作為基質并產生協同作用，而其中有機酸會在不同條件下對植物生長、土壤環境等產生影響，以及對礦物中某些元素釋放產生促進。植物通過根系分泌有機酸是改善根際環境的重要手段，也是體現植物生長情況的重要指標[6～9]。

由于地下化學的不可見性和復雜性，以及根系分泌物成分的多樣性，研究對PAHs根系分泌物的脅迫還存在一定困難。目前研究主要集中在根際環境對PAHs的降解，且研究對象多為農作物或一年生草本[10，11]，而根系分泌物具體組分與PAHs之間的研究并不多見。樟樹作為中國南方主要綠化樹種，研究樟樹根系分泌物中有機酸對PAHs的響應，闡明PAHs脅迫下根系分泌物中有機酸的響應機理，探尋根系分泌物有機酸在不同濃度PAHs下的動態變化規律，為解釋根系分泌物對PAHs降解機理提供理論基礎。

2 研究方法

2.1 試驗地概況

實驗地設在湖南省長沙市中南林業科技大學城市生態站實驗室內。實驗室地處東經112°48′，北緯28°03′，年均氣溫16.8 ℃，降雨量1400 mm，無霜期為270～300 d，屬典型的亞熱帶濕潤季風氣候。實驗室系不銹鋼微框架結構的溫室，面積1400 m2。

2.2 實驗材料和方法

為了模擬當地土壤中多環芳烴對樟樹幼苗產生的影響，需要對脅迫源進行選擇和配比。本研究參照張引文對當地樟樹林根際土多環芳烴的研究，確定用于脅迫的多環芳烴成分為PHE（菲）、FLA（熒蒽）、PYR（芘）、NAP（萘）、FLO（芴），各比例分別為，26∶9∶8∶8∶5。研究共設置500 g對照濃度和1500 g處理濃度，分別為C（總PAHs含量為0），L（總PAHs含量為1.5 mg/kg）、M（總PAHs含量為7.5 mg/kg）和H（總PAHs含量為75 mg/kg），其分別約為當地土壤中多環芳烴含量的1倍、5倍和50倍。

試驗于2015年4月選取樟樹1年生且苗高和長勢基本一致的幼苗進行栽培，植物根系進行適當修剪后用0.15%的福爾馬林溶液表面滅菌，用自來水輕輕沖洗掉附于根部的泥沙將幼苗移植到Φ10cm塑料盆中，每盆裝滅菌蛭石350 g，每種處理3盆，每盆3株。緩苗40 d后，拔出幼苗測定其根系活性。培養基使用純水在4 ℃條件下浸泡24 h，浸泡液過濾后濃縮至50 mL以下定容，測定根系分泌物中有機酸、TOC、TN含量。TOC及TN利用日本島津TOC-500測定儀進行測定。有機酸采用飛行時間質譜測定，質譜分析使用5800基質輔助激光解離飛行時間質譜（MALDI TOF/TOF，Applied Biosystems， 美國） 配備200Hz Nd：YAG激光源 （355 nm），用二級MS/MS激光激發200次，并去除信噪比低于50的信號。

3 結果與分析

3.1 根系活性和TOC、TN的測定

測定根系活性和TOC、TN目的是研究吸收能力和根系分泌物的總量特征，是輔助說明根系分泌物有機酸在PAHs脅迫下響應特征的重要指標。根據圖1可知，總吸收面積測定的結果M處理最大（P<0.05），達到了4.96 m2，其次是C處理和L處理，兩者之間沒有顯著差異（P>0.05），H處理最小，為3.84 m2。活躍面積測定的結果顯示，L處理和M處理在4個處理中最大（P<0.05），但兩者差異不顯著（P>0.05），分別達到了4.21 m2和4.33 m2，H處理最小（P<0.05），為2.23 m2。比表面積的測定結果表明，M處理下最大（P<0.05），達到0.44，其余處理沒有顯著差異（P>0.05）。

TOC的測定結果表明（圖2），各處理之間差異顯著（P<0.05），依次為L處理10.24 m/L>C處理5.23 m/L >M處理4.47 m/L >H處理2.21 m/L。TN反映的規律和TOC相似，同樣為L處理7.74 m/L>C處理6.31 m/L >M處理2.15 m/L >H處理1.13 m/L（P<0.05）。

對根系活性和TOC、TN的測定表明與對照（C處理）相比，PAHs對植物根系活性和產生有機酸能力的影響因處理方式不同而不同，較低的PAHs添加會在一定程度上促進植物的生長，而較高的PAHs添加會抑制植物在這兩個方面的能力。

3.2 根系分泌物中有機酸的測定

本研究分別對4種處理的根系分泌物進行了測定，質譜圖見圖3。通過對波峰出現時的質合比及其分子離子峰，共判讀出6種含量一致且常見的低分子有機酸，詳見表1。6種有機酸的相對豐度因處理方式不同而表現出差異性，其變化趨勢見圖4。

乙酸隨著PAHs脅迫程度的增加顯示出先降低后增高的趨勢，并在H處理達到最高，達到130.78%，但總體變化程度相較其他5種有機酸較小。丙二酸在M處理下較L處理有所降低，但仍高于對照處理，總體上隨著PAHs脅迫程度的增加整體呈現上升趨勢，并在H處理達到最高，達到323.08%。對羥基苯甲酸隨著PAHs脅迫程度的增加呈現先升高后降低的現象，在M處理下最高1129.41%，并在H處理下迅速下降至70.59%。香草酸、沒食子酸、檸檬酸3種有機酸表現相似，都為降低-升高-降低，在M處理下最高H處理下最低。

4 結語

根系活性和對根系分泌物TOC、TN的測定表明，M處理下根系的活性最高，根系分泌物中TOC、TN含量也最大，說明PAHs的添加在一定程度上促進了樟樹幼苗的生長，根系分泌物質的能力增加，但在H處理下根系的活性最低，根系分泌物物質的能力也最低。這與已有一些PAHs的添加實驗的表現一致。陸志強[12]對秋茄幼苗的研究結果指出；低濃度（0.1 mg/L）的奈和芘對進幼苗生長有促進作用，高濃度組（10 mg/L）則顯著抑制了幼苗生長；沈小明[13]研究玉米生長對菲的響應時指出，低濃度的菲（1 mg/L）顯著促進玉米生物量的增加，隨著菲濃度升高（5 mg/L）玉米正常生長會受到抑制；王姣龍[14]等在對4中綠化樹種幼苗進行芘添加時也發現相似現象。由于本研究脅迫使用的PAHs是以當地自然沉降的成分為基礎，所以也可以說明當前PAHs沉降水平會對研究地樟樹的根系活性產生一定的影響，總體上不顯著，在未來一段時間內隨著沉降量的增高，可能會在一定程度對植物生長繼續產生促進作用，如果沉降量繼續上升超過樟樹的耐受極限，會極大抑制樟樹的根系活性。

6種有機酸對PAHs響應在不同的方面既表現出差異性也表現出一致性。總體上看，可根據分子量解釋其變化特征：乙酸、丙二酸分子量相對較低的有機酸含量隨著PAHs脅迫程度的增加表現出上升趨勢；對羥基苯甲酸、香草酸、沒食子酸和檸檬酸分子量相對較高的有機酸含量隨著PAHs脅迫程度的增加在M處理下達到峰值，但隨著脅迫程度的繼續升高在H處理下迅速降低。同時，在羥基苯甲酸、香草酸、沒食子酸和檸檬酸中有3種含有環狀結構。Baker的研究結果[15]表明濃度較低的PAHs對植物生長有促進作用，可能是由于PAHs的苯環與植物一些生長激素具有類似環狀結構。結合本研究根系活性和TOC、TN的測定結果可知這3種含環狀結構的有機酸的變化規律與之相同，這個現象表明這3種有機酸可以作為說明樟樹幼苗根系活性的指標，同時也可能對樟樹幼苗生長產生促進作用。

本研究根據當地PAHs自然沉降成分特點，通過模擬添加不同濃度PAHs混合物對樟樹幼苗進行脅迫，提取培養基中根系分泌物，研究了根系分泌物中6種有機酸的變化規律。研究雖然取得了較好的結果，但由于地下化學的不可見性和復雜性，以及根系分泌物成分的多樣性，根系分泌物中有機酸對PAHs的響應尚不能使用明確的數學關系表達，需要在未來進一步展開研究。

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Abstract： In this study， according to the PAHs local composition characteristics of natural sedimentation， 4 PAHs mixture concentration gradient C （total PAHs0 mg/kg）， L （total PAHs 1.5mg/kg）， M （total PAHs 7.5mg/kg） and H （total PAHs 75mg/kg） were set and stressed to extract the root exudates of the camphor tree seedlings. The low molecular organic acids were determined by MALDI TOF/TOF to explore the changes of organic acids in root exudates. The results showed that the content of organic acid acetic acid， malonic acid， relatively low molecular weight increased with the degree of PAHs stress showing an upward trend. The molecular weight of p-hydroxybenzoic acid， vanillic acid， gallic acid and citric acid was relatively high. The acid content reached the peak at the M treatment with the increase of PAHs stress， but decreased with the increase of stress level under H treatment. The content of hydroxy benzoic acid， vanillic acid and gallic acid were consistent with the changes of plant root activity and TOC， TN.

Key words： root exudate；PAHs；organic acids；MALDI TOF/TOF