2008～2013年—2013年上海市售海產品中副溶血性弧菌污染的監測和毒力基因分析小結

田明勝+彭少杰+陳波+厲曙光

摘要： 目的了解上海市市售海產品中副溶血性弧菌的污染水平和特征。方法2008～2013年，采用GB/T 4789.7-2008《食品衛生微生物學檢驗副溶血性弧菌檢驗》方法，對上海市批發市場、集貿市場、賣場超市、餐飲環節和網購環節等污染物監測點采集的市售海產品進行副溶血性弧菌污染的定量檢測，對副溶血性弧菌食品分離株采用PCR方法對其進行毒力基因耐熱直接溶血素（tdh）、耐熱直接溶血素相關溶血素（trh）的檢測。結果 共監測市售海產品2643件，共在192件樣品中檢出副溶血性弧菌，總體檢出率7.3%；2.6%（5/192）的菌株tdh或trh陽性，tdh和trh的攜帶率分別為2.1%（4/192）和0.5%（1/192）。不同監測月份、不同食品類別和不同采樣地點的海產品，其副溶血性弧菌污染水平總體上存在差異（ P<0.05）。其中6～10月份海產品副溶血性弧菌檢出率和樣品平均濃度顯著高于其他月份（P<0.05）；海產魚類的副溶血性弧菌檢出率（8.4%）和幾何平均濃度（0.209 MPN/g） 顯著高于其他種類海產品（P<0.05）；批發市場、集貿市場和賣場超市采集海產品副溶血性弧菌濃度顯著高于其他場所（ P<0.05）。結論上海市售海產品中副溶血性弧菌在夏秋季節污染較高，部分食品分離株攜帶有tdh或trh基因，應繼續開展海產品中副溶血性弧菌污染的風險監測和探索其環境影響因素，并針對副溶血性弧菌污染的高風險節點開展風險評估和管理。

關鍵詞： 海產品； 副溶血性弧菌； 監測； 毒力基因

Analysis of contamination and virulence genes of Vibrio parahaemolyticusin seafoodsduring 2008～2013 in Shanghai markets

MingshengTiana，b，ShaojiePengb，Bo Chena，ShuguangLia*，

（a Department of Nutrition and Food Hygiene， School of Public Health， Fudan University， 130Dong An Road， Shanghai， China.b General Enforcement Team of Shanghai Food and Drug Administration， 615Liu Zhou Road， Shanghai， China.）

Abstract： ObjectiveTo investigate and characterize the contamination ofVibrio parahaemolyticus in seafoods inShanghai markets.MethodsBased on the method of GB /T 4789. 7-2008 Microbiological Examination of Food

Hygiene：Examination of V.parahaemolyticus，the contamination of V. parahaemolyticus in seafoods from

different predeterminedmonitoring sites in Shanghai was quantitatively determined and the occurrence of virulence genesthermostable direct hemolysin （tdh） and TDH-related hemolysin （trh）， in 192 seafoodssepalatedVibrio parahaemolyticusstrains was detectedby PCR.ResultsA total of 2643 seafoodsamples from wholesale markets，retail markets，supermarkets，catering industries and online shoppingswere collected from January to December in the years of 2008 to 2013.V.parahaemolyticuswas found in 192 samples （ 7.3% ） .Among 192 separated strains， 2.6% （5/192） carry tdh or trh. 2.1%（4/192）were positive for tdh， and 0.5% （1/192） were positive for trh；The geometricmean densities of V. parahaemolyticuswere different significantly in varied seafoodsspecies，sampling monthes，as well aslocations（ P<0. 05） .Especially，geometricmean densitiesof V.parahaemolyticusin June to October were significantly higher than those in othermonths （ P<0. 05） .the detection rate （ 8.4% ） andgeometricmean densities（0.209 MPN/g ） of V.parahaemolyticusin fishes was significantly higher than other seafoods（ P<0. 05 ）. The geometricmean densitiesof V.parahaemolyticus in seafoodsfrom wholesale markets，retail markets，supermarketswere higher than those from other sampling

resources （ P<0. 05）.ConclusionThe contamination ofV.parahaemolyticus inseafoods during summer and fall was relatively high from Shanghai markets .some separated Vibrio parahaemolyticusstrains take virulence genestdh and trh. Thus the contamination of V.parahaemolyticus in seafoodsneeds to be intensively monitored and environmental impact factor should be searched for implementing risk assessment and management on high risk points for Vibrio parahaemolyticuscontamination.

Key words： Seafoods； Vibrio parahaemolyticus；Contaminant Monitoring； Virulence Genes

副溶血性弧菌（ Vibrio parahaemolyticus，以下簡稱VP） 是一種重要的食源性致病菌，廣泛存在于近海岸的海水、海底沉積物和海產品中，主要引起急性胃腸炎和原發性敗血癥。國家食源性疾病監測網1992～2001年的數據顯示，VP食物中毒居微生物食源性疾病之首，占31.1%，中毒食品主要是海產品[1]；2003～2007 年食源性疾病監測網報告的細菌性食源性疾病暴發資料中，由VP導致的中毒事件數報告數為308起，涉及發病人數8234人，分別占同期細菌性食源性疾病報告起數和人數的29.1%和25.5%[2]；上海2000～2007 年期間報告的集體性食物中毒事件中由VP引起的起數和患者人數分別占同期起數和人數的57.4% 和56.0%[3]。

為了解上海市售海產品中VP的污染水平和毒力基因特征，2008-2013年對上海市售海產品的VP污染情況進行了連續監測。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

根據本市食品中食源性致病菌污染監測計劃，在水產批發市場、集貿市場、賣場超市、餐飲環節和網購環節等固定監測點，按照無菌采樣原則采集各類生鮮海產品2643件，樣品包括海產魚類、海產貝類、海產蝦類、海產蟹類和海產頭足類。采樣后樣品于2～8℃冷藏條件下保存運輸送實驗室，采樣后3h內進行實驗室檢驗；網購樣品于冷鏈條件下運輸至實驗室，在樣品開箱驗視包裝完整后即刻進行實驗室檢驗。

1.2 檢測方法

采用GB/T 4789.7-2008《食品衛生微生物學檢驗副溶血性弧菌檢驗》方法進行VP的定量檢測，2008年5月～2010年10月間，3個稀釋度的檢樣量分別為0.1g、0.01g和0.001g，最低檢出限<3.0 MPN/g；2011年1月～2013年12月間，3個稀釋度的檢樣量分別為1.0g、0.1g和0.01g，最低檢出限<0.3 MPN/g。檢測VP陽性菌株在-80℃冷凍保存，在年末集中對本年檢測分離的VP菌株進行耐熱直接溶血素（thermostable direct hemolysin，tdh）和tdh相關溶血素（TDH-related hemolysin，trh）毒力基因的檢測，其中tdh1[4]的引物序列（5～3）為上游：GGTACTAAATGGCTGACATC，下游：CCACTACCACTCTCATATGC；tdh2[5]的引物序列（5～3）為上游：GTAAAGGTCTCTGACTTTTGGAC，下游：GGAATAGAACCTTCATCTTCACC；trh1[4]的引物序列（5～3）為上游：GGCTCAAAATGGTTAAGCG，下游：CATTTCCGCTCTCATATGC；trh2[5]的引物序列（5～3）為上游：TTGGCTTCGATATTTTCAGTATCT，下游：CATAACAAACATATGCCCATTTCC。

1.3 統計方法

用Excel 軟件進行數據導入，統計分析采用SPSS 18.0。參考文獻[6]中m=-（2.303/V）*log（S/n）計算公式，按年月分層后計算未檢出樣品中VP污染的最可能值，其中S為陰性樣品件數，n為測試樣品件數，V為取樣量。VP濃度經對數轉化后符合正態分布，樣品VP平均濃度用幾何均數表示，不同組間VP平均濃度方差齊時采用單因素方差分析，方差不齊時采用非參檢驗的秩和檢驗。

2 結果

2.1 不同監測年份海產品中VP的污染情況

不同監測年份海產品產品VP濃度總體差異有統計學意義（P<0.05）。6年間VP平均濃度最高的為2009年（3.090 MPN/g），其次為2010年（2.188 MPN/g）和2008年（1.778 MPN/g），2011～2013年間VP平均濃度顯著降低，并且其檢出率也顯著低于2008-2010年。除2011年VP陽性菌株中未發現產毒基因外，其余5年均在其中1株分離株中發現tdh或trh基因，見表1。

2.2 不同監測月份海產品中VP的污染情況

不同監測月份海產品VP濃度總體差異有統計學意義（P<0.05）。VP檢出率和VP平均濃度前3位依次為8月份（16.6%，1.023MPN/g）、7月份（14.6%，0.55 MPN/g） 和9月份（8.3%，0.417 MPN/g）。11月～4月海產品VP污染則是偶有檢出，其污染水平顯著低于5月～10月。tdh或trh基因則主要集中在7月、8月和9月檢測發現的VP陽性分離株中，見表2。

2.3各類海產品中VP的污染情況

不同種類海產品VP濃度總體上差異有統計學意義（P<0.05）。各類海產品濃度最高為海產魚類（0.209 MPN/g），最低為海產蟹類（0.023 MPN/g），海產蝦類、海產貝類和海產頭足類VP污染平均濃度總體上無差異。tdh或trh基因則主要集中在海產魚類、海產蝦類和海產蟹類的VP陽性分離株中，見表3。

2.4不同采樣地點海產品中VP的污染情況

不同采樣地點海產品VP濃度總體差異有統計學意義（P<0.05）。其中，批發市場、集貿市場和賣場超市海產品VP檢出率和濃度均顯著高于其他采樣地點相應指標（P<0.05），餐飲環節海產品中VP檢出率和濃度均顯著低于前述三個環節，而網絡環節的22件海產品中未見有VP檢出，tdh或trh基因則主要集中在批發市場、集貿市場和餐飲環節，其中餐飲環節有3株VP陽性菌株均檢出tdh基因，見表4。

3 討論

VP污染已成為我國東南沿海省份一個嚴重的食品安全問題。海產品是VP食源性污染的主要媒介。美國1973～1998 年所有VP食源性暴發的媒介均為海產品或與海產品交叉污染的食品[7]。日本全國調查發現，VP腸炎主要由海產魚、貝類及其加工產品引起[8]。作為一種食源性致病菌，人群VP食物中毒的發生和食品中VP污染量有關。

近年來，國內已陸續開展海產品中VP的定量監測。劉秀梅等[9]于2003年9～12月對福建、廣東、江蘇和浙江4省市場上的海產品VP污染進行主動監測，VP總體檢出率為38.6%，其中甲殼類、貝類和魚類檢出試樣VP濃度分別為171.4、76.9 和50.8MPN/100g。陳艷等[10]于2003年4～8月對福州和廈門市場上的牡蠣進行了VP污染的定量研究，試樣VP的檢出率為58.4%，平均濃度為60MPN/100 g；彭少杰等[11]于2008～2010年夏秋季節對來自上海市場的海水產品VP污染進行了監測和報道，檢出率為13.2%，檢出幾何均值為2.4 MPN/g。和本研究相比，上述研究相應海產品總體檢出率雖然顯著高于本研究（7.3%），但VP污染濃度卻基本類似或處于同一數量級上，檢出率差異可能和樣品產地、抽樣月份、檢驗方法、濃度結果的計量單位等不同有關，但本研究是在一個更大的時間跨度（連續6年并且在后面3年具體到每月）內抽樣檢驗的，對于分析海產品中VP污染的季節變異性更有實踐意義。

本研究顯示，上海地區不同監測點、不同品種和不同月份海產品的VP檢出率和VP 濃度均存在差異。其中，批發市場、集貿市場和賣場超市采集海產品VP濃度顯著高于其他場所（P<0. 05），這可能與海產品捕撈后儲存運輸和銷售期間是否能始終保持冷藏冷凍狀態等因素有關[12]；海產魚類的VP檢出率（8.4%）和樣品平均濃度（0.209 MPN/g） 顯著高于其他種類的海產品（ P<0. 05），與海產魚是上海地區主導消費海產品，一年四季均有不同種類銷售，而蟹貝類則有明顯季節性供應有關；6～10月份海產品VP檢出率和樣品平均濃度顯著高于其他月份（ P<0.05），這既與本市6～10月份常為VP集體性食物中毒高發月份[3]相吻合，也與Depaola等[13]的研究揭示的在海產品產地海域水溫超過20℃時VP污染濃度較高結果相一致，提示零售市場上海產品中VP的污染水平既與捕撈海域海水溫度的季節性變化有關[14]，又和捕撈后儲存運輸和銷售期間環境溫度是否能抑制細菌生長間有較為密切的關系[15]。

上海市售海產品中VP污染較為嚴重，部分食品分離株攜帶有tdh或trh基因，若銷售和消費環節貯藏溫度不當和時間過長則易導致海產品中VP大量繁殖，而居民常有在夏秋季節生食或半生食熗蝦、醉蝦等海產品的習慣，這可對公眾健康構成威脅。監管部門應在夏秋季節加強海產品零售和儲存期間海產品冷藏冷凍溫度的監管，避免儲存溫度過高可能導致的VP大量增殖；而餐飲企業則需要在夏秋季節加工海產品時防止交叉污染，以及烹飪時的燒熟煮透；風險監測部門應繼續對市售海產品開展連續性的定量監測，探索其環境影響因素，并針對副溶血性弧菌污染的高風險節點開展風險評估、交流和管理。

參考文獻

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