重組人粒細胞刺激因子蛋白特性及蛋白重折疊過程雜質研究

李潛 李巖異 侯麗媛 張彩喬 張衛婷

摘 要：重組人粒細胞刺激因子（rhG-CSF）是用于治療化療所致的中性粒細胞減少癥。來源于基因工程的細胞表達的包涵體，包涵體經過變性、復性和分離純化等步驟處理后得到藥用級別的rhG-CSF。本文根據重組人粒細胞刺激因子蛋白結構特性，對包涵體裂解復性過程中蛋白質重折疊過程進行總結，通過對其重折疊過程的研究，以便于找尋到更優化裂解復性條件，提高下游生產回收率，提高工業生產效益。

關鍵詞：重組人粒細胞刺激因子（rhG-CSF）；包涵體；裂解復性；蛋白質重折疊

重組人粒細胞刺激因子（rhG-CSF）是近20年來發展起來的最令人激動的新藥物，也是世界上最暢銷的五種重組類生物藥物之一。

粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factors，G-CSF）是能夠在體內外特異地作用于中性粒細胞系，促進其增殖、分化，并能維持功能和存活的一種糖蛋白類生長因子[ 1 ]。其在刺激造血細胞的增殖、分化和血細胞的功能活性中發揮著重要作用。例如，它可以刺激相應的定向造血祖細胞分裂，預防細胞凋亡，并啟動造血亞群發育并成熟。

1 重組人粒細胞刺激因子蛋白特性及在大腸桿菌中的表達特性

成熟的人類G-CSF是一個由帶有O 聯糖鏈的174個氨基酸組成分子質量為19.0kd的糖蛋白，在Cys36-Cys42和Cys64-Cys74之間有一個分子內二硫鍵，有一個游離的半胱氨酸殘基17。

天然的人粒細胞刺激因子在蘇氨酸（Thr133）有一個O-糖基化位點，這個位點可以保護蛋白免受聚集，但該位點并不影響蛋白活性。

人G-CSF cDN A有兩種不同的形式，分別編碼174和177個氨基酸的成熟蛋白。兩種mRNA來源于同一前體分子，其形成機理是選擇性剪接，兩種不同的G-CSF cDNA分子生物學活性差別較大，174個氨基酸形式的G-CSF比177個氨基酸形式的G-CSF生物學活性高出50倍以上。G-CSF的編碼基因位于17q21-22，長約23 kb，含有5 個外顯子和4 個內含子[ 2 ]。

大腸桿菌表達重組蛋白已經成為生產藥用蛋白的首選表達系統。rhG-CSF是通過重組DNA技術在大腸桿菌中表達蛋白藥物，以滿足醫療上的需求。大腸桿菌表達的重組人粒細胞刺激因子rhG-CSF，和相同的內源性蛋白質有相同的生物活性，但不同的是它氨基端有一個未糖基化的蛋氨酸殘基。大腸桿菌表達的非糖基化重組人粒細胞刺激因子同樣具備生物學活性。rhG-CSF分子量約18.8kDa、非糖基化、具有175個氨基酸殘基、多出來的氨基酸為N端的甲硫氨酸、攜帶兩條二硫鍵是生物學活性所必需。

圖1為重組G-CSF蛋白一級結構[ 3 ]。大腸桿菌中表達的重組人粒細胞刺激因子的Cys37-Cys43和Cys65-Cys75之間有一個分子內二硫鍵，有一個游離的半胱氨酸殘基18。

重組蛋白在大腸桿菌中的高水平表達在體內通常積累為不溶性蛋白、無活性聚合物包涵體。它們通過沉積而發生錯折疊或通過疏水性基團的暴露和隨之發生的分子間相互作用部分折疊為多肽。蛋白質含有二硫鍵，由于細菌細胞質的還原環境抑制二硫鍵的形成，因此蛋白質聚集體包涵體的形成是預料之中的。因此我們需要對包涵體進行體外重折疊，以形成有活性的蛋白天然構象。

前期研究表明，rhG-CSF在大腸桿菌中表達水平為10%。最初，通過改變在基因5端GC含量表達水平可以提高到17%；通過引入沉默突變表達水平提高到35%；利用合成基因表達活性可以到達30%[ 4 ]。

雖然蛋白質的表達是在中度到高度的水平，終產物的產量很少，遠不能令人滿意。這很可能是由于下游工藝的效率低下，例如蛋白質包涵體分離后的純度和回收率較低，錯誤折疊，聚體的形成和蛋白質的復性條件未經優化以及層析過程。如此多的步驟很麻煩，并且總產率較低，因此高度控制的復性及純化工藝參數是必不可少的。

2 蛋白質重折疊

蛋白質重折疊是一個動態的過程，包括一級結構中氨基酸側鏈的非共價結合形成二級結構，和進一步側鏈的排序和組裝以達到一種相對穩定狀態，最終形成功能齊全的天然結構。任何蛋白質的特定構象在很大程度上是由多肽鏈的序列以及側鏈的特定的分子間的相互作用決定的。各種作用力在蛋白質的重折疊過程中扮演著積極的角色，包括氫鍵形成，疏水作用（疏水性氨基酸殘基在內部核心），共價相互作用（蛋氨酸和/或半胱氨酸），范德華力，靜電相互作用（帶電表面極性側鏈）。除了這些，主鏈和側鏈由于限制運動產生的構象熵也在蛋白質重折疊形成一個穩定結構中扮演著重要角色。人們一直認為，蛋白質折疊和由此產生的天然構象是獨立自主支配的，并且由一個特定蛋白的氨基酸的序列及其天然溶劑環境決定的。

3 裂解復性過程不同形式雜質特性及形成過程

重組人粒細胞刺激因子蛋白包涵體主要的雜質包括脂多糖、宿主細胞蛋白、質粒DNA、RNA聚合酶等各種酶。在重組人粒細胞刺激因子包涵體裂解復性過程中，蛋白重折疊時氧化型及還原型、f-met型和聚體等是rhG-CSF的主要雜質。在所有類型的雜質中f-met型，是在蛋白表達過程中產生。氧化型及還原型異構體和聚體是最重要的兩類雜質，是在包涵體復性過程產生的，這兩類雜質會影響產品的安全性及有效性。因此針對這三類雜質有必要進行重點研究。G-CSF含有5個半胱氨酸殘基，可形成兩對二硫鍵（位于36-42，和64-74），二硫鍵的特性及數量影響蛋白表明的疏水性，通過高效液相我們可以分析出各種組分的疏水性差異。

我們已經很清楚，除f-met型及聚體雜質外，其余類型G-CSF的疏水性為：還原型>天然型>氧化型。還原型組分為蛋白鏈完全未折疊，而氧化型為蛋白鏈均形成了二硫鍵但并不是天然結構的結合順序。

根據高效液相的出峰時間判斷二硫鍵的配對情況。實驗發現，稀釋復性過程中，在剛稀釋完成時有38%的正確構象的蛋白，說明了自發形成二硫鍵的情況。復性30分鐘后，超過90%的蛋白已經折疊，其中80%的蛋白已經形成了正確的二硫鍵并折疊。在30分鐘至16小時的時間里，正確折疊的蛋白比例達到83%，蛋白濃度為0.25mg/ml。這在A.C Herman和H.J.Dyson的研究中均有提及，二硫鍵Cys37-Cys43比 Cys65-Cys75形成速度快。這就是為什么在復性的前30分鐘內，氧化型組分和天然組分的百分比增長顯著。兩個分子內二硫鍵，Cys37-Cys43 Cys65-Cys75，形成的兩個小環是已知的生物活性的關鍵，并且研究表明，二硫鍵的形成在其自身重折疊的最初30min內完成。

二級結構中的螺旋結構在復性2小時后趨于平穩并形成穩定的二級結構，在0-2小時的過程中會形成幾種中間體，影響螺旋結構的穩定性?？梢酝ㄟ^核磁共振檢測不同復性時間的蛋白的變化程度，在0-2.5小時的蛋白溶液顯示峰為1.9ppm，三小時后峰變為1.6ppm并直到16小時一直未發生明顯變化，中說明需要至少3小時。盡管在重折疊30min后蛋白質功能完善（二硫鍵形成完成），在30min后的不當處理可能會導致蛋白的聚合并且導致產品收率受損?；谌缟蠑祿?，在這些操作條件下推薦重折疊至少2h。同時聚體也在復性的4小時后明顯增多。

4 應用

根據上述重人粒細胞刺激因子蛋白特性及復性過程的變化特性，可以設計并優化工業化生產工藝，復性過程中前30分鐘是氧化型異構體快速形成過程，因此在此過程中盡量減少促進蛋白氧化的因素，如過度攪拌，氧化劑濃度等。

通過深入了解重人粒細胞刺激因子蛋白特性及復性動力學過程，可為工業化生產提供理論支持，為復性工藝的摸索和優化提供更多的思路和方法。

參考文獻：

[1] Zsebo K M，Cohen A M，Murdock D C，Boone T C，Inoue H， Chazin V R， Hines D， Souza L M. Recombinant human granulocyte colony stimulating factor： molecular and biological.

[2] Nagata S， Tsuchiya M ， Asano S， Kaziro Y， Yamazaki T， Yamamoto O， Hi rata Y， Kubota N， Oh eda M ， Nomura H. Molecular cloning and expression of cDNA for human granulocyte.

[3] Basu，S.， Dunn， A.， & Ward， A. （2002）. International Journal of Molecular Medicine，10，3-10.

[4] Kang， S. H.， Na， K. H.， Park， J. H.， Park， C.， Lee， S. Y. and Lee， Y. I. （1995） Biotechnol. Lett.17，687-692.

[5] A.Hawe，M. Sutter， W. Jiskoot， Extrinsic fluorescent dyes as tools for protein characterization，Pharm. Res.25（2008），1487-1499.

[6] H.J. Dyson， P.E. Wright， Unfolded proteins and protein folding studied by NMR， Chem. Rev. 104（2004），3607-3622.