大鼠骨缺損愈合里骨痂的形成過(guò)程中H19的表達(dá)情況

蘇 杭姚軍威

(武漢體育學(xué)院研究生院,湖北武漢430079)

大鼠骨缺損愈合里骨痂的形成過(guò)程中H19的表達(dá)情況

蘇 杭姚軍威

(武漢體育學(xué)院研究生院,湖北武漢430079)

研究目的:通過(guò)檢測(cè)H19在骨損傷之后愈合過(guò)程中的表達(dá)變化探討骨損失愈合的相關(guān)細(xì)胞和H19的關(guān)系。研究方法:大鼠左后肢股骨做骨缺損造模,右后肢股骨做假手術(shù)處理。于5d、10d、15d、20d、25d斷頸法處死。實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定H19表達(dá)。研究結(jié)果:在5d到25d中,H19在損傷組和對(duì)照組均有表達(dá);損傷后5d,實(shí)驗(yàn)組H19的表達(dá)量是對(duì)照組的兩倍;損傷后10d,實(shí)驗(yàn)組H19的表達(dá)量是對(duì)照組的兩倍;損傷后15d、20d、25d,實(shí)驗(yàn)組H19的表達(dá)量和對(duì)照組H19的表達(dá)量基本持平。研究結(jié)論:H19促進(jìn)骨細(xì)胞的增殖與分化,可加速骨損傷的愈合。

骨損傷愈合;印記基因;H19

胚胎發(fā)育8周左右，圍繞脊髓的部分開(kāi)始通過(guò)胚胎結(jié)締組織的間葉分化，形成膜化骨。大多數(shù)膜化骨之后被軟骨化骨所替換，軟骨成骨進(jìn)一步發(fā)展為骨，一小部分骨是直接從膜化骨衍生而來(lái)的。結(jié)締組織膜衍生骨，稱為骨化始于胚胎，直到骨骼發(fā)育完成。原骨是由膜骨化而來(lái)的，次骨是由軟骨骨化而來(lái)的。

重新構(gòu)建骨的連續(xù)性即稱作骨愈合，屬于平衡機(jī)制的細(xì)胞修復(fù)過(guò)程，伴隨多個(gè)因子參與，多個(gè)因素影響，其生物學(xué)過(guò)程復(fù)雜而多變。細(xì)胞的增殖、分化、募集、遷移，都參與骨的重塑。各種細(xì)胞生長(zhǎng)因子的旁分泌和自分泌，骨損傷愈合過(guò)程中骨修復(fù)細(xì)胞的分化和增殖，對(duì)骨形成的調(diào)節(jié)有著十分重要的作用。

印記基因是指同源基因只表達(dá)親本來(lái)源其中的一個(gè)，而從另一方不表達(dá)。精卵結(jié)合，基因遺傳給后代時(shí)，父系和母系等位基因發(fā)生改變，進(jìn)而表達(dá)特點(diǎn)發(fā)生改變，于是印記發(fā)生。同鏈順式作用位點(diǎn)稱為印記中心，該中心成簇存在80%的印記基因。異常的印記基因表達(dá)會(huì)導(dǎo)致多種缺陷類(lèi)疾病。有研究發(fā)現(xiàn)，在胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育中，印記基因是作為重要的調(diào)節(jié)器發(fā)生作用的。

損傷后的骨再生，是局部骨的再發(fā)育的過(guò)程，目前骨修復(fù)和印記基因之間的關(guān)系報(bào)道基本屬于空白。創(chuàng)傷中常常存在一些常見(jiàn)的疾病，如骨質(zhì)疏松、骨折、骨缺損、骨折延遲愈合、骨折不愈合和愈合緩慢，所以促進(jìn)新骨生長(zhǎng)在治療中是極為重要的。在這項(xiàng)研究中，檢測(cè)印記基因H19在骨損傷修復(fù)部位的表達(dá)，探索印記基因與骨損傷修復(fù)的關(guān)系，為臨床上治療骨傷，促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)發(fā)育等提供一些必要的理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

實(shí)驗(yàn)組：左后肢做骨缺損造模，麻醉處理，左后肢剪毛，沿股骨長(zhǎng)軸方向做3cm開(kāi)口，撥開(kāi)肌肉，于股骨中段骨皮質(zhì)上做切口，切至髓腔即刻停止，青霉素消毒縫合。

對(duì)照組：右后肢做假手術(shù)處理。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材

分別于傷后5d、10d、15d、20d、25d采用斷頸法處死，取適量左右后側(cè)股骨組織。分組標(biāo)記并處理：-80℃下保存，多聚甲醛固定。

1.3 RT-PCR法

1.3.1 總RNA提取

（1）標(biāo)本于-80℃或液氮中保存，用已經(jīng)消毒的工具于冰上取約100mg組織，Trizol研磨，倒入1.5ml EP管中，加入三氯甲烷250μl，混勻，冰上靜置。

（2）混合液，4℃ 10000g，10min離心。超凈工作臺(tái)操作，取上清500μl，加入等體積3℃預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻，-20℃靜置15min。

（3）溶液4℃，10000g，10min離心，小心倒掉液體，加入1mL 4℃預(yù)冷的75%乙醇，清洗RNA沉淀。4℃，10000g，5min離心，倒掉液體，干燥數(shù)分鐘，乙醇充分揮發(fā)，加入20μl RNase-Free Water，溶解RNA。

1.3.2 第一鏈cDNA合成

第一鏈cDNA的合成采用First Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行

（1）取11μlRNA溶液，加入1μl oligo（dT）18，于PCR儀上65℃保溫5min，迅速置冰上冷卻2min。

（2）依次加入4μL 5×buffer，2μl 10mM dNTPs，1μlRNA inhibitor和1μl反轉(zhuǎn)錄酶，用PCR儀處理。

1.3.3 熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在Life technologies公司的StepOneTMReal-Time PCR上完成，每個(gè)樣品均作3個(gè)復(fù)孔，使用SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行：

反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

預(yù)變性 95℃，1min

循環(huán)（40次） 95℃，15s→58℃，20s→72℃，20s

末段延伸 72℃，5min

溶解曲線 72℃→95℃，每20s升溫1℃

反應(yīng)體系為：

2× qPCR Mix 5.0μL

引物工作液（2.5μM） 1.0μL

Template 1.0μL

ddH2O 2.8μL

Rox 0.2μL

Total 10μL

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

從曲線圖看出：GAPDH、U6、H19溶解曲線沒(méi)有雜峰，峰形窄、尖，表明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性良好；H19擴(kuò)增曲線光滑呈S型，指數(shù)擴(kuò)增期、平臺(tái)期明顯，表明擴(kuò)增結(jié)果理想。

2.2 不同時(shí)期實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組H19 CT值情況

如圖1，在骨損傷愈合過(guò)程中，5d和10d損傷組H19比對(duì)照組明顯升高，非常具有顯著性差異（P＜0.01）。15d、20d、25d實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的H19表達(dá)基本無(wú)變化，沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。隨著愈合進(jìn)程的推移，表達(dá)量逐漸下降。

3 分析討論

3.1 骨損傷愈合過(guò)程

圖1

骨損傷后的修復(fù)是一個(gè)特殊的過(guò)程，不同于結(jié)締組織的纖維狀瘢痕，細(xì)胞和分子事件有序發(fā)生產(chǎn)生新骨。產(chǎn)生新骨的一系列有序過(guò)程受到系統(tǒng)和局部因子的調(diào)控，早期組織學(xué)理論認(rèn)為，人體骨折愈合的一般模式是以軟骨內(nèi)成骨為基礎(chǔ)，按時(shí)間順序分為血腫、炎癥、血管再生、軟骨發(fā)生到骨發(fā)生最后是骨的重構(gòu)。很少見(jiàn)到基于沒(méi)有骨膜反應(yīng)和可見(jiàn)骨痂形成的膜化骨的直接愈合。膜化骨和軟骨化骨的特點(diǎn)是由不同的細(xì)胞遷移分化，細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)鈣的形成和組織，以及局部和系統(tǒng)調(diào)控的不同所決定的。除了骨折愈合的經(jīng)典組織學(xué)進(jìn)程，對(duì)于這些進(jìn)程的調(diào)控機(jī)制在細(xì)胞和分子水平還存在許多未解的問(wèn)題。

胚胎發(fā)育過(guò)程中的骨形成是由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的聚集和凝聚，隨后通過(guò)軟骨發(fā)育進(jìn)而軟骨內(nèi)骨化，或通過(guò)成骨細(xì)胞分化進(jìn)而膜內(nèi)骨化。雖然在成人骨里骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞極其稀少，骨膜里的骨祖細(xì)胞和骨髓里未分化的多能間充質(zhì)干細(xì)胞，參與愈合組織的形成，這對(duì)骨折的愈合構(gòu)建非常重要。

骨損傷后，骨損傷區(qū)域有血腫發(fā)生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。骨損傷后5d，血腫基本完全清除，原始骨痂由骨膜反應(yīng)形成，骨損傷處充質(zhì)細(xì)胞集結(jié)，骨膜下骨祖細(xì)胞增殖。骨折后10d骨損傷處肉芽組織生長(zhǎng)，骨膜反應(yīng)持續(xù)增長(zhǎng)，骨膜下骨祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，軟骨細(xì)胞形成。骨折后15d，新生骨小梁在骨膜下形成。骨折后20d，膜內(nèi)成骨區(qū)骨小梁開(kāi)始相互連接，成骨細(xì)胞向骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，成骨細(xì)胞零星分布于軟骨骨痂中和纖維骨痂中。骨折后25d，膜內(nèi)成骨區(qū)骨小梁融合成片，新的骨小梁漸漸取代軟骨骨痂。

3.2 H19與細(xì)胞分化

在最近的發(fā)現(xiàn)中，印記基因在細(xì)胞分化方面具有至關(guān)重要的作用，包括在胚胎干細(xì)胞（ESCs），誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞（iPSCs）和成人干細(xì)胞。在雄性和雌性生殖細(xì)胞中，親代等位基因可以被獨(dú)立標(biāo)記時(shí)基因組印記建立。基因組印記的建立發(fā)生在印記擦除之后，是表觀遺傳重組以及整體基因組去甲基化的一部分，對(duì)于細(xì)胞分化能力必不可少。然而，現(xiàn)在的研究表明當(dāng)iPSCs來(lái)自于分化的體細(xì)胞時(shí)，在基因重組中可以避免一些生殖細(xì)胞特異性重組。在發(fā)育中一個(gè)重要的疑問(wèn)是IPSC技術(shù)里，重組過(guò)程中印記能否被維持。例如，核移植（NT）-克隆的老鼠一般表現(xiàn)出表觀遺傳不穩(wěn)定性和LOH，患有各種與印記基因相關(guān)的疾病。

這些細(xì)胞將來(lái)可以被用來(lái)研究基礎(chǔ)發(fā)育過(guò)程或用于人類(lèi)治療。LOH不僅可以導(dǎo)致早期生長(zhǎng)發(fā)育障礙，而且與細(xì)胞分化和癌癥也高度相關(guān)。例如H19 Peg1 Peg3，是已知的腫瘤抑制基因。此外，“imprint-free”小鼠ESCs 具有完全的LOH，對(duì)于嵌合體發(fā)育產(chǎn)生明顯的效果。因此，對(duì)于IPSCS中印記基因的表達(dá)和功能需要仔細(xì)研究，這些研究結(jié)果對(duì)于胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞的印記分析，突出了具有分化能力的多能干細(xì)胞群中印記基因功能的重要性。

印記基因與成體干細(xì)胞群的維持和功能密切相關(guān)。父系peg3表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠顯示成體鼠的PEG3在各種組織中的干細(xì)胞群中表達(dá)受限，包括大腦、腸、骨骼、肌肉和皮膚。神經(jīng)球的生成，是通過(guò)體外神經(jīng)元分離和擴(kuò)增技術(shù)形成的，在此過(guò)程中導(dǎo)致了約100%的PEG3陽(yáng)性細(xì)胞的生成。此外，在表皮移植實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)移PEG3陽(yáng)性細(xì)胞在毛囊干細(xì)胞壁龕中具有自我更新和分化能力。這些實(shí)驗(yàn)表明，PEG3在成體干細(xì)胞中起著功能性作用，但目前尚不清楚這些作用是否與早期發(fā)育中所體現(xiàn)出的作用不同。

小鼠中，母系表達(dá)的H19基因與成人造血干細(xì)胞（HSC）群的維持有關(guān)。誘導(dǎo)母系HSCs H19/IGF2 ICR刪除，可使H19表達(dá)減少和IGF2表達(dá)增加，同時(shí)造血干細(xì)胞數(shù)目短期內(nèi)增加，長(zhǎng)期減少，逐漸喪失造血潛能和功能。此外，母系H19/Igf2 ICR 的刪除通過(guò)增加IGF2表達(dá)量，降低IGF1r表達(dá)量導(dǎo)致IGF2-IGF1R通路的不適當(dāng)?shù)募せ睿琁GF1r是miR-675的靶位點(diǎn)。這導(dǎo)致由FOXO3介導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯相關(guān)的靜止受到抑制，最終導(dǎo)致活化以及長(zhǎng)期HSCs耗盡。此外，研究證實(shí)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）及其壁龕選擇性丟失DLK1印跡對(duì)于后天神經(jīng)形成至關(guān)重要。DLK1是Notch信號(hào)的膜結(jié)合受體，出生后大多數(shù)組Notch信號(hào)下調(diào)。小鼠DLK1缺陷導(dǎo)致慢區(qū)分神經(jīng)干細(xì)胞減少，從而導(dǎo)致成人嗅球神經(jīng)元耗竭。神經(jīng)干細(xì)胞和周?chē)男切文z質(zhì)細(xì)胞從兩個(gè)等位基因表達(dá)DLK1，而DLK1只從父系等位基因表達(dá)。DLK1這種協(xié)調(diào)雙等位基因表達(dá)凸顯了印記基因調(diào)控環(huán)境特異性的重要性，以及基因劑量對(duì)印記基因的重要性。

本研究中，大鼠骨損傷造模后5d到10d，骨膜反應(yīng)形成原始骨痂，骨膜下骨祖細(xì)胞增殖向成骨細(xì)胞分化，骨損傷處有大量間充質(zhì)細(xì)胞聚集。在此期間，實(shí)驗(yàn)組H19表達(dá)量明顯增加且是對(duì)照組的兩倍，15d到25d基本無(wú)變化。在間充質(zhì)細(xì)胞和骨祖細(xì)胞等干細(xì)胞分化過(guò)程中，H19高表達(dá)，說(shuō)明H19參與調(diào)控間充質(zhì)細(xì)胞、骨祖細(xì)胞分化，其具體機(jī)制還不清楚。

4 結(jié)論

H19可以促進(jìn)大鼠骨細(xì)胞的增殖與分化，加快損傷部位愈合。

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蘇杭（1993—），女，湖南省邵陽(yáng)人，碩士研究生，運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)。

姚軍威（1990—），男，江蘇徐州人，碩士研究生，運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)。