干酪乳桿菌抗熱保護劑的Plackett-Burman試驗研究

陳 合， 寇建波， 楊 妍， 張 萍， 舒國偉

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

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干酪乳桿菌抗熱保護劑的Plackett-Burman試驗研究

陳 合， 寇建波， 楊 妍， 張 萍， 舒國偉

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

益生菌是功能性食品的主要功能因子，干酪乳桿菌L61具有較強的產抗氧化肽的能力.選取6種抗熱保護劑，采用Plackett-Burman試驗研究其干酪乳桿菌L61的抗熱性能，以提高噴霧干燥制備干酪乳桿菌奶粉中的活菌數及抗氧化性.結果表明：甘油、脫脂乳和葡萄糖對干酪乳桿菌L61存活率影響最為顯著，優化確定了 3種物質作為干酪乳桿菌抗熱保護劑的最適添加量，即脫脂乳18 g/L、葡萄糖6%、甘油13 mL/L，為噴霧干燥制備高活性干酪乳桿菌奶粉提供了技術依據.

抗熱保護劑； 干酪乳桿菌L61； 羊奶粉； 抗氧化

0 引言

益生菌是維護人體健康的重要功能因子[1].干酪乳桿菌作為益生菌的一種，進入人體后可在腸道內存活，調節腸內菌群平衡、促進腸道消化吸收[2]、具有降膽固醇、增強免疫及預防癌癥和抑制腫瘤生長等保健作用[3,4].已廣泛應用于功能性食品中，特別是乳制品的開發.

自20世紀50年代Harman提出了自由基學說(free radical theory)以來，人們逐漸認識到人體內氧化產生的自由基與其衰老及許多疾病有關.因此，具有清除自由基和抑制脂質過氧化功能的抗氧化劑成為研究的熱點，乳源抗氧化肽等天然抗氧化肽更是引起人們的關注[5-7].

目前乳源抗氧化肽主要采用酶解蛋白制備，發酵乳蛋白制備抗氧化肽的文獻不多，而關于抗氧化的益生菌產品、特別是含有產抗氧化肽的益生菌奶粉少有報道.課題組在前期從25株益生菌中篩選出四株發酵羊乳產抗氧化肽能力較強的乳桿菌[8]，并對干酪乳桿菌L61發酵羊乳產抗氧化肽的工藝條件進行了優化.本研究在此基礎上，以含抗氧化肽的益生菌發酵羊乳為原料，采用噴霧干燥制備干酪乳桿菌L61抗氧化益生菌羊奶粉，研究篩選抗熱保護劑，以改變在噴霧干燥過程中的物理、化學環境，減輕高溫對細胞損害，提高干酪乳桿菌的存活率[9,10]，為后續抗氧化益生菌羊奶粉的中試及產業化提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

(1)主要材料：干酪乳桿菌L61，陜西科技大學食品與生物工程學院；脫脂羊乳粉，富平縣秦源乳業有限公司； DPPH，Sigma公司；甘油、脫脂乳粉、葡萄糖等，均為食品級；MRS肉湯培養基、MRS瓊脂培養基，均為北京陸橋技術股份有限公司；復原乳培養基，蒸餾水將脫脂羊乳粉配制為11%(w/v)的復原羊乳，105 ℃滅菌15 min.

(2)主要儀器：YX.280D手提式壓力蒸汽滅菌鍋，江陰濱江醫療器械廠；FA2004B電子天平，上海精科天美科學儀器有限公司；LG10-2.4型離心機，北京醫用離心機廠；FJ-200高速分散均質機，上海索映儀器設備有限公司；DH5000AB電熱恒溫培養箱，天津市泰斯特儀器有限公司；DK.98.1型電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；pHs-3C型pH計，上海精科儀器公司；SW-CJ-IF無菌操作臺，蘇州江東精密儀器有限公司.

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化

將冷凍保存的干酪乳桿菌L61菌粉接種于已滅菌冷卻的MRS肉湯培養基中，充分混勻后于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h得到一代活化液，再取上述活化液按5%(v/v)接種于MRS肉湯培養基中于37 ℃培養24 h得到二代活化液，如此重復活化三代，第三代培養時間為18 h.

將上述獲得的第三代活化液按5%接入11%(w/v)復原脫脂羊乳培養基中，混勻后于37 ℃恒溫培養箱中培養至凝乳后置于4 ℃冰箱備用.

1.2.2 發酵乳制備

將11%復原脫脂羊乳于105 ℃滅菌15 min，待其冷卻后按5%接種量接入已活化菌種，置于41 ℃恒溫水浴發酵16 h后取出，得到含抗氧化肽的干酪乳桿菌發酵乳.

1.2.3 抗熱保護劑篩選

在干酪乳桿菌發酵乳中加入不同保護劑并于75 ℃恒溫水浴中保溫10 min.測定保溫前后活菌數并計算存活率.

1.2.4 檢測方法

(1)活菌數測定

按照GB 4789.35-2010，采用稀釋涂布平板計數法，每一樣品選取三個稀釋梯度，每一梯度做三個平行實驗以求得平均值.

(2)酸度測定

采用氫氧化鈉滴定法[11].取5 mL發酵液注入容量為150 mL的三角瓶中，加入45 mL蒸餾水稀釋，加入2～3滴1%酚酞指示劑，用0.l mol/L NaOH標準溶液滴定，不斷輕微搖動三角瓶，直至微紅色在30秒內不消失為止，即為滴定終點.將滴定時消耗的0.1 mol/L NaOH標準溶液的毫升數乘以20，即為100 mL發酵液的滴定酸度(°T).

(3)pH測定

室溫下用pHs-3c測定.

(4)抗氧化性測定

發酵羊乳乳清樣品制備：將發酵乳充分震蕩搖勻并倒入燒杯中，測定pH.先用1 mol/L的鹽酸溶液調節發酵乳pH至3.4～3.6，5 000 r/min離心15 min，取上清液；將上清液再用1 mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH至8.3后，5 000 r/min離心15 min，取上清液，此上清液即為用于測定抗氧化性的待測樣品溶液[12].

羥自由基清除率表示抗氧化性大小.采用紫外分光光度計，分別移取2 mL待測樣品溶液、2 mL硫酸亞鐵溶液(9 mmol/L)和2 mL過氧化氫溶液(10 mmol/L)注入到10 mL的試管中充分震蕩混合，37 ℃ 孵育10 min，加入2 mL水楊酸溶液(9 mmol/L)，混勻后37 ℃孵育30 min，于510 nm 處測定混合溶液的吸光度，每組三個平行，求平均值.純水做空白對照組[13].

清除率=(1-對照組/試驗組) ×100%

2 結果與討論

2.1 Plackett- Burman試驗結果分析

選取蔗糖(X2)、脫脂乳粉(X3)、葡萄糖(X4)、海藻糖(X6)、明膠(X8)、甘油(X9)等六種常見保護劑，設計高低水平(1和-1)P-B試驗.各個因素水平編碼如表1所示，P-B試驗結果如表2所示.其中X2、X4、X6 及X8為質量分數(%)，X3為質量體積分數(g/L)，X9為體積分數(mL/L)；響應值Y1為菌體存活率(%)，Y2為羥基自由基清除率(%)，Y3為酸度(°T)，Y4為 pH值.不加保護劑作為對照組，存活率為0.68%.

表1 抗熱保護劑P-B篩選編碼表

表2 抗熱保護劑P-B試驗設計及結果

隨著羊乳發酵的進行，產酸增多，其pH值和酸度有所變化，但均在正常范圍內，表明發酵性能良好.其各因子對響應值Y1的置信區間如圖1所示，顯著效應如圖2所示.對響應值Y2的置信區間如圖3所示，顯著效應如圖4所示.

圖1 各因子對于菌體存活率的置信區間

由圖1可知， X9對于響應值Y1的影響呈正效應，即菌體存活率隨著因子添加量的增加而增大；因子X2、X3、X4對于響應值Y1的影響呈現負效應，即菌體存活率隨著因子添加量的增加而減小；因子X8、 X6對響應值Y1幾乎無影響.其中X1、X5、X7為虛擬項，用于消除試驗中誤差.

由圖2可以看出，因子X3對響應值Y1的影響效果最明顯，并且各個因子對于菌體存活率的影響顯著性效果先后順序為：X4(葡萄糖)>X3(脫脂乳)>X9(甘油)>X2(蔗糖)>X6(海藻糖)>X8(明膠).P-B試驗結果表明，影響菌體存活率較為突出的三個因子分別為脫脂乳、葡萄糖、甘油.

圖2 各因子對于菌體存活率的顯著性效應圖

由圖3可知，因子X2、X3、X9對發酵羊乳抗氧化性的影響呈現正效應，即響應值Y2隨各因子添加量的增加而增大；而其余因子X4、X6、X8對于抗氧化性呈現負效應關系，即抗氧化性隨著因子添加量的增加而減小.其中X1、X5、X7為虛擬項.

圖3 各因子對抗氧化性的置信區間

從圖4可以看出，X6對響應值Y2的影響最為顯著，各因子對發酵羊乳抗氧化性的顯著性依次為：X6(海藻糖)>X3(脫脂乳)>X4(葡萄糖)>X9(甘油)>X8(明膠)>X2(蔗糖).

圖4 各因子對抗氧化性的顯著性效應圖

2.2 驗證試驗及結果分析

各因子對發酵羊乳抗氧化性和菌體存活率結果不完全一致，因此進行驗證試驗.其中，a表示在發酵乳中添加脫脂乳、葡萄糖和海藻糖；b表示在發酵乳中添加脫脂乳、葡萄糖和甘油.其結果如表3所示.

表3 對比試驗設計及結果

本研究目的主要在于研究菌體保護劑，最大可能的提高菌體存活率，為后續工廠化采用噴霧干燥法制備益生菌羊奶粉篩選抗熱保護劑.同時，由表3可知，海藻糖與甘油對于發酵羊乳抗氧化性結果差異不是很大.因此，綜合分析考慮最終選取葡萄糖、脫脂乳、甘油三個因子的爬坡試驗.

2.3 爬坡試驗設計及結果分析

基于上述結果確定葡萄糖、脫脂乳及甘油爬坡試驗起點，選取合適的步長進行爬坡試驗，確定后續響應面試驗中心點.爬坡試驗設計與結果如表4所示.

由表4可知，爬坡實驗中，發酵羊乳pH值隨著登高步數的增加先增后減；活菌數、存活率和抗氧化性隨著登高步數的增加均呈現先增后減的趨勢，當各因子添加量的取值在第二步時，菌體存活率及抗氧化性均達到最大值，即脫脂乳18 g/L、葡萄糖6%、甘油13 mL/L

表4 抗熱保護劑爬坡試驗設計及結果

2.4 糖、乳及甘油抗熱保護劑分析

糖類保護劑生物作用目前有“水代替假說”和“玻璃態假說”兩種學說[14,15].其中“水代替假說”認為糖的羥基可以代替蛋白質極性基團的周圍水分子形成氫鍵，達到保護菌體的作用；而“玻璃態假說”認為糖-水混合物會發生玻璃化，保護劑包圍在蛋白質周圍，防止蛋白質變性.脫脂乳粉之所以可以起到良好的保護效果，是因為乳清蛋白在菌體細胞外可以形成一層蛋白膜，減少菌體胞壁破損引起細胞內物質外露[16].甘油進入菌體細胞以后，使得胞內溶質濃度增大，內外壓力基本相等，從而有效的減緩了菌體因受熱時細胞出現脫水的現象[17].

范娜等[18]研究采用響應面試驗優化嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌混合菌體的抗熱保護劑，結果表明，海藻糖、明膠和甘油均能夠提高菌體的抗熱存活率，并且三者之間存在交互作用.

3 結論

葡萄糖、脫脂乳和甘油均對干酪乳桿菌L61有較好的抗熱保護作用，優化確定的抗熱保護劑的最適添加量為脫脂乳18 g/L、葡萄糖6%、甘油13 mL/L時，抗熱保護效果最佳，活菌數最高，為噴霧干燥制備高活性干酪乳桿菌奶粉提供了技術依據.

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【責任編輯：陳 佳】

Study on thermal protective agent ofLactobacilluscaseiby Plackett-Burman design

CHEN He, KOU Jian-bo, YANG Yan, ZHANG Ping, SHU Guo-wei

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

Probiotics are the main functional factors of functional foods,andLactobacilluscaseiL61 has strong ability to produce antioxidant peptides.The effects of six kinds of heat-resistant protective agent on heat resistance ofLactobacilluscaseiL61 were investigated,and the viable cell number and antioxidant activity inLactobacilluscaseiL61 milk powder by spray drying were improved by Plackett-Burman design.The results showed that glycerol,skim milk and glucose had the most significant effect on survival ofLactobacilluscaseiL61.Therefore,these 3 substances were chosen as thermal protective agents ofLactobacilluscaseiL61,and the additive amount of the three kinds of protective agents was determined: skim milk 18 g/L,glucose 6%,glycerol 13 mL/L,which laid provided a technical basis for the preparation of high activityLactobacilluscaseimilk powder by spray drying.

thermal protective agent；LactobacilluscaseiL61； goat milk powder； antioxidant activity

2017-01-29

陜西省農業廳農業科技創新轉化項目(NYKJ-2015-004)

陳 合(1956-)，男，陜西咸陽人，教授，研究方向：食品生物技術與工程、功能性乳制品

2096-398X(2017)04-0122-04

TS201.3

A