腺苷注射液治療肺挫傷的作用機制

吳衛春　張麗萍　杜　峰　梁　治　林　偉　王勝利

腺苷注射液治療肺挫傷的作用機制

吳衛春張麗萍杜峰梁治林偉王勝利

目的 探討腺苷注射液對撞擊所致肺挫傷的治療作用機制。方法 選取30只健康日本大耳兔，隨機分為對照組和腺苷注射液治療組，各15只。用 BIM-II型生物撞擊機制備兔肺挫傷模型。分別于撞擊前10min﹑撞擊后1h﹑3h﹑5h﹑7h采集頸總動脈血檢測丙二醛（MDA）﹑白介素-10（IL-10）的濃度；于傷后7h取下右肺，測定肺組織中髓過氧化物酶（MPO）含量；測定支氣管肺泡灌洗液中的腫瘤壞死因子-α（ TNF-α）含量和肺泡表面活性物質（PS）水平；解剖觀察肺組織和病理改變。結果 對照組血漿MDA濃度﹑肺組織中MPO含量﹑支氣管肺泡灌洗液中TNF-α濃度﹑NE活性較腺苷組顯著升高，而腺苷組血漿IL-10濃度和支氣管肺泡灌洗液中總磷脂TPL含量較對照組明顯高，同時腺苷治療組肺組織的病理損害明顯較對照組減輕。結論 腺苷注射液對肺挫傷有治療作用，其機制可能與調節肺挫傷早期炎性因子濃度有關。

胸部損傷 肺 腺苷注射液

肺挫傷是指暴力作用于胸壁，使胸腔容積縮小，增高的胸內壓力壓迫肺組織，引起肺出血、水腫；外力消除后胸廓回彈，在產生胸內負壓的瞬間又導致原損傷區再次受損［1］。臨床上對肺挫傷的治療尚缺乏有效的藥物。國內外在腺苷預處理對肺的保護作用［2］已有較深入的研究。2012年6月至2014年6月作者通過實驗觀察腺苷對肺挫傷的治療作用，并探討其可能機制，旨在為臨床救治肺挫傷提供方法和實驗依據。

1　材料與方法

1.1動物分組及模型建立 健康日本大耳兔30只，雌雄不限，體重2.0～2.5kg，由溫州醫科大學實驗動物中心提供，隨機分為對照租（單純撞擊組）和腺苷組（撞擊后腺苷注射液干預組），各15只，撞擊后立即予等滲鹽水經兔耳緣靜脈滴注維持循環穩定7h，腺苷組于撞擊后30min開始予腺苷注射液3mg/（kg·h）經耳緣靜脈滴注（沈陽光大制藥）。參照吳正國等［3］的方法用BIM-2水平式生物撞擊機制，制備兔肺挫傷模型。將兔架直立，撞擊兔右側胸部，撞擊點位于兔右側第3、4肋間與腋中線交界處，撞擊參數：采用準靜態撞擊，驅動壓力為650kPa，撞擊面積為4cm2，胸壁壓縮3cm，撞擊時相為吸氣末，撞擊后呼吸循環穩定，未出現嚴重并發癥。

1.2標本采集與測定 分別于撞擊前10min、撞擊后1h、3h、5h、7h采頸總動脈血檢測丙二醛（MDA）、白介素-10（IL-10）。血清MDA含量測定采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法；血清IL-10采用ELISA測定；于傷后7h取下右肺，取其中的0.1g肺組織采用比色法測定肺組織中髓過氧化物酶（MPO）含量；按常規方法收集支氣管肺泡灌洗液（BALF），ELISA試劑盒測定支氣管肺泡灌洗液中的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量；測定肺泡表面活性物質（PS）水平，收集BALF以2層無菌紗布過濾后以1500r/min離心10min，分離出上清液，分裝后置-20℃保存待測定，測定總磷脂TPL和中性粒細胞彈性蛋白酶NE活性。試劑盒均購自上海西塘生物科技有限公司，操作按試劑盒說明進行。取右下肺1cm×1cm×1cm大小組織作光鏡檢查，隨機取兩組中各8只兔肺作電鏡檢查，觀察肺組織形態學改變。

1.3統計學分析 采用SPSS 12.5統計軟件。計量資料以（±s）表示，組內比較用單因素方差分析，組間比較用t檢驗，方差不齊用Dunnett’s T3檢驗，方差齊用LSD檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1兩組兔血漿MDA濃度的變化比較 見表1。

表1　兩組兔血漿MDA濃度變化比較［nmol/ml，（x±s］

2.2兩組兔血漿IL-10濃度的變化比較 見表2。

表2　兩組兔血漿IL-10濃度變化比較［pg/ml，（x±s）］

2.3兩組兔肺組織中MPO、TNF-α、NE、TPL比較 見表3。

表3　兩組兔肺組織MPO、TNF-α、NE、TPL比較（x±s）

2.4兩組肺組織形態學變化 對照組肺組織實變明顯，表面有散在紅色斑片，光鏡下肺泡結構破壞，部分萎縮，大量中性粒細胞為主的炎性細胞及紅細胞、血小板等聚集（見圖1A）；電鏡下II型細胞部分破壞，相鄰肺泡間質水腫增厚，線粒體腫脹空泡化，微絨毛和板層小體稀少（見圖1B）。腺苷組光鏡下肺泡結構基本正常，PMN少（見圖1C）；電鏡下肺泡II型細胞形態基本正常，肺泡壁薄，肺泡間隔輕度水腫，線粒體無明顯腫脹，微絨毛較多，板層小體豐富（見圖1D）。

圖1　兩組肺組織形態學改變（A﹑B光鏡，C﹑D電鏡）

3　討論

胸部撞擊后肺挫傷的機制目前尚未完全清楚。血漿MDA為自由基脂質過氧化的醛式產物，是脂質過氧化代謝的主要中間產物，其醛基能與血管內皮、神經元等細胞生物膜磷脂中的氨基組分發生交聯聚合反應，使生物膜的結構和功能發生改變，引起膜通透性增加、膜上的Na+-K+-ATP 酶失活、線粒體功能障礙等，從而導致細胞內Ca2+超載，并激發自由基鏈式反應，并形成惡性循環。本資料用硫代巴比妥酸比色法測定MDA的含量，不僅反映氧自由基生成與否及其清除情況，還反映出氧自由基造成組織損傷的嚴重程度。血漿IL-10是一種抗炎癥細胞因子，其具有較強的抗炎作用，可以抑制某些因子如IFN-γ、IL-1-β、IL-2、TNF-α等的合成及活性，降低各自的mRNA水平及粘附分子的表達［4］；同時又對抗炎癥物質如IL-1Ra具有正向調節作用，提高其濃度和活性。MPO是中性粒細胞胞漿中的一種特異性酶，肺組織中MPO活性的變化可反映中性粒細胞在肺組織的聚集程度，標志中性粒細胞活化和聚集。“呼吸爆發” 是激活的中性粒細胞釋放氧自由基的方式，釋放的氧自由基引起肺組織脂質過氧化損傷，同時釋放彈性蛋白酶、溶酶體酶等損傷和破壞肺組織結構導致肺水腫。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）由單核巨噬細胞、T細胞釋放，是一種具有廣泛生物學效應的細胞因子，能參與體內多種疾病的發生和發展。TNF-α可以引起體內一系列的病理反應，如誘導中性粒細胞的“呼吸爆發”；刺激多種細胞因子的生成、釋放，參與到肺水腫的形成；表達細胞粘附分子，激活白細胞粘附活性［5］。El-Awady等［6］通過對肺挫傷患者的支氣管肺泡灌洗液分析，發現肺挫傷導致肺泡Ⅱ型上皮細胞生成和分泌的表面活性物質減少；同時以TNF-α為主的肺泡內的炎性因子使表面活性物質降解加速。PS的減少和呼吸道內分泌物的阻塞促使肺不張的發生。肺不張一方面影響肺的通氣換氣功能，另一方面又進一步加重肺部炎癥反應，并形成惡性循環，加重肺損傷。

外源性腺苷未作為能量底物發揮作用，其主要作用于腺苷受體，其可能的機制為：（1）抑制中性粒細胞（PMNs）、內皮細胞及其相互作用：國外學者發現，腺苷可以抑制內皮細胞凋亡［7］，且可抑制PMNs的CD11/CD18表達和抑制血小板活化因子［8］。（2）減輕細胞內鈣超載：腺苷激活A1受體，開放ATP敏感K通道（KATP），通過電壓依賴性Ca2+通道，降低Ca2+內流，保護細胞內ATP［9］，該作用可被KATP通道阻滯劑所阻斷［10］。（3）腺苷可以有效恢復高能磷酸儲備。（4）腺苷還可以抑制血小板的聚集，防止血栓的形成：研究證實腺苷能降低ADP誘導的血小板聚集，抑制血栓烷素A2的釋放，從而保護內皮細胞的結構和功能，且通過降低細胞內Ca2+濃度，抑制Ca2+誘發的血小板聚集。（5）腺苷的抗氧化作用：Rupprecht H等［11］通過實驗發現腺苷對氧自由基有顯著的抑制作用，腺苷可通過腺苷A2受體使中性粒細胞產生的超氧陰離子減少。

1 王正國.我國道路交通傷的現狀，中華創傷雜志，2000，16（4）：200～201.

2 劉勇，賀春熙.腺苷預處理對小兒體外循外肺損傷的保護作用，醫學研究雜志，2012，41（5）：77～79.

3 吳正國，梁貴友，李正勛，等. 參芪扶正注射液對心肌挫傷后家兔心肌細胞凋亡的影響. 第三軍醫大學學報，2007，29（7）：588～591.

4 Avdic S， Cao JZ， McSharry BP， et al. Human cytomegalovirus interleukin-10 polarizes monocytes toward a deactivated M2c phenotype to repress host immune responses.J Virol，2013， 87（18）：10273～10282.

5 Vinokurov M， Ostrov V， Yurinskaya M， et al. Recombinant human Hsp70 protects against lipoteichoic acid-induced inflammation manifestations at the cellular and organismal levels. Cell Stress Chaperones， 2012， 17（1）：89～101.

6 El-Awady MS， Rajamani U， Teng B， et al. Evidence for the involvement of NADPH oxidase in adenosine receptors-mediated control of coronary flow using A1 and A3 knockout mice. Physiol Rep， 2013， 1（3）：163～170.

7 Zhao ZQ， Nakamura M， Wang NP， et al. Administration of adenosine during reperfusionreduces injury of vascular endothelium and death of myocytes. Coron Artery Dis，1999， 10（8）：617～628.

8 Kaji W， Tanaka S， Tsukimoto M， et al. Adenosine A（2B） receptor antagonist PSB603 suppresses tumor growth and metastasis by inhibiting induction of regulatory T cells. J Toxicol Sci， 2014， 39（2）：191～198.

9 Lochner A， Marais E， Huisamen B， et al. Protection of the ischaemic heart： investigations into the phenomenon of ischaemic preconditioning. Cardiovasc J Afr， 2009， 20（1）：43～51.

10 G Kounis N， Soufras GD ， Tsigkas G ，et al.Adverse cardiac events to monoclonal antibodies used for cancer therapy： The risk of Kounis syndrome. Oncoimmunology， 2014， 14（3）： e27987.

11 Rupprecht H， Ghidau M. Penetrating nail-gun injury of the heart managed by adenosine-induced asystole in the absence of a heart-lung machine. Tex Heart Inst J， 2014， 41（4）：429～432.

Objective To investigate the mechanism of adenosine injection in the treatment of lung contusion following chest impact. Methods Thirty healthy Japan big-ear rabbits were randomly assigned to the lung contusion control group（control group，n=15）and adenosine injection group（adenosine group，n=15）.The rabbits with lung contusion were induced by BIM-II Horizontal Bioimpact Machine. Blood samples were taken from common carotid artery of both groups to measure the levels of plasma malondialdehyde（ MDA） and IL-10 at 10 minutes before impact and1，3，5，7 hours after impact.Rabbits were dissected to observe the gross and micmpathological changes of the lung at 7 hours after impact，the lung tissue myeloperoxidase（MPO） acticity and tumor necrosis factor-A（TNF-α） and elastase（NE） contents in bronchalveor lavage fluid（BALF） were obtained. Results The control group showed a distinct increasing of plasma MDA and the lung tissue MPO acticity and TNF-α and NE contents in BALF，The morphological observation revealed severe lung tissue injury as well. The adenosine group showed a distinict inreasing of plasma IL-10 and TPL contents in BALF. Conclusion Adenosine injection has therapeutic effect on lung contusion by regulating infl ammatory factor levels in the early period after lung contusion.

Thoracic injuries Lung Adenosine injection

杭州市衛生科技計劃資助項目（2012B029）

311100 浙江大學醫學院附屬第二醫院余杭分院心胸外科 （吳衛春 張麗萍 杜峰 梁治 林偉 ）325035 溫州醫科大學附屬第二醫院 （王勝利）