紅霉素酶聯(lián)免疫試劑盒在環(huán)境水樣中的檢測(cè)效果評(píng)價(jià)

羅曉琴，韓深，萬(wàn)宇平，王佩月，崔廷婷

(1. 北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206；2. 北京市食品安全免疫快速檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，北京 102206；3. 北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，北京 100026)

紅霉素酶聯(lián)免疫試劑盒在環(huán)境水樣中的檢測(cè)效果評(píng)價(jià)

羅曉琴1,2，韓深3，萬(wàn)宇平1,2，王佩月3，崔廷婷1,2

(1. 北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206；2. 北京市食品安全免疫快速檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，北京 102206；3. 北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，北京 100026)

通過(guò)檢測(cè)酶聯(lián)免疫試劑盒的檢測(cè)限、精密度、準(zhǔn)備度、交叉反應(yīng)率等各項(xiàng)技術(shù)參數(shù)，并將其精密度和準(zhǔn)確度與HPLC法做對(duì)比，以評(píng)價(jià)ELISA方法對(duì)環(huán)境水樣中紅霉素殘留的檢測(cè)效果。結(jié)果表明：紅霉素ELISA試劑盒的檢測(cè)限為1μg/L；試劑盒工作范圍為0.2～16.2μg/L；精密度、準(zhǔn)確度結(jié)果與HPLC法一致；且試劑盒使用方便、前處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)耗時(shí)短(55 min)、成本低，適用于現(xiàn)場(chǎng)篩查和水質(zhì)監(jiān)控，可滿足對(duì)環(huán)境水樣中紅霉素殘留的快速檢測(cè)。

紅霉素測(cè)定；酶聯(lián)免疫試劑盒；檢測(cè)效果；HPLC；環(huán)境水樣

紅霉素是由紅霉素鏈霉菌產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯系的代表性抗菌素。作用機(jī)制在于其主要與核糖核蛋白體的50S亞單位相結(jié)合，抑制肽酰基轉(zhuǎn)移酶，影響核糖核蛋白體的移位過(guò)程，妨礙肽鏈增長(zhǎng)，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，是抑菌劑。因此廣泛應(yīng)用于畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖中的細(xì)菌性疾病的治療和防治[1]。

由于紅霉素在動(dòng)物體內(nèi)代謝時(shí)間較長(zhǎng)，因此不可避免地在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生殘留，給人畜帶來(lái)危害[2,3]。同時(shí)，紅霉素經(jīng)動(dòng)物體代謝后大部分以母體化合物或代謝體的形式經(jīng)動(dòng)物糞便和尿液排出體外，進(jìn)入環(huán)境介質(zhì)。水中的沉積物是紅霉素的主要富集場(chǎng)所，水生動(dòng)植物(如水草、斑馬魚(yú)等)也對(duì)紅霉素表現(xiàn)出一定的吸收富集能力[4]，通過(guò)食物鏈被人體吸收后蓄積在肝、腎中，給人類帶來(lái)毒副作用，如腹瀉、惡心、嘔吐、過(guò)敏反應(yīng)等[5]。

雖然目前紅霉素在環(huán)境水樣中的最大殘留限量沒(méi)有明確規(guī)定，但我國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告[6]和歐盟EC1181/2002[7]規(guī)定紅霉素在動(dòng)物組織中的最大殘留限量為 200 μg/kg，另外美國(guó)規(guī)定豬可食性組織中的紅霉素最高殘留限量為100 μg/kg，日本規(guī)定水生動(dòng)物中紅霉素最高殘留限量為200μg/kg[8]。

目前，紅霉素殘留檢測(cè)主要應(yīng)用高效液相色譜法(HPLC)[9-11]、薄層色譜法[12]、液相色譜-質(zhì)譜法[5,13,14]、微生物法[15,16]和酶聯(lián)免疫法(ELISA)[3,17]，檢測(cè)樣本一般包括蜂蜜、牛奶、畜禽組織、水產(chǎn)品(魚(yú)、蝦)等。對(duì)于環(huán)境中殘留抗生素的檢測(cè)主要采用液相色譜-質(zhì)譜法、分光光度法、離子液體體系萃取、雙水相體系萃取等[18-23]，但有關(guān)環(huán)境水樣中紅霉素殘留酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的研究未見(jiàn)報(bào)道。本文旨在對(duì)檢測(cè)環(huán)境水樣中紅霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒的檢測(cè)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期實(shí)現(xiàn)紅霉素殘留的現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本的定量篩查。

1 材料、儀器與方法

1.1 材料和儀器

水樣；紅霉素、硫氫酸紅霉素、琥乙紅霉素、泰樂(lè)菌素、替米考星、螺旋霉素、北里卡星等標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)；紅霉素殘留酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(北京勤邦生物技術(shù)有限公司)。

MK3酶標(biāo)儀(上海雷勃分析儀器有限公司)、渦旋混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)、微量移液器(美國(guó)Thermo)、DHP-600生化培養(yǎng)箱 (天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐)、Milli-Q Reference 純水儀(美國(guó)Millipore公司)、高效液相色譜儀(美國(guó)Thermo)、電子天平(美國(guó)Setra)、振蕩器(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

取水樣100μL至2mL離心管中，加入400μL復(fù)溶工作液，用渦旋儀充分渦動(dòng)，混勻；取50μL用于分析。

1.2.2 樣品檢測(cè)

將所有試劑與酶標(biāo)板放實(shí)驗(yàn)桌上回溫至室溫(20～25℃)；將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行；向包被有紅霉素抗原的酶標(biāo)板微孔中加入50mL/孔的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品或樣本，然后加入酶標(biāo)二抗50mL/孔，再加入抗體工作液50mL/孔，輕輕振蕩混勻后，置于37℃避光環(huán)境中反應(yīng)40min；洗滌4～5次，每次間隔10s，倒掉洗滌液，用吸水紙拍干；加入底物液A液、B液各50mL/孔，振蕩搖勻后置于37℃避光環(huán)境中反應(yīng)15min；加入終止液50mL/孔，振蕩搖勻，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的吸光度值(OD450)。

1.2.3 結(jié)果計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的平均吸光度值除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品(0標(biāo)準(zhǔn))的平均吸光度值，再乘以100%；以各標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)(lg[C])為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出百分吸光率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的紅霉素濃度，即為IC50。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中紅霉素的實(shí)際濃度[24]。

1.2.4 試劑盒技術(shù)參數(shù)評(píng)價(jià)

精密度和準(zhǔn)確度測(cè)定。按2μg/L、5μg/L兩個(gè)濃度的紅霉素對(duì)環(huán)境水樣進(jìn)行添加回收測(cè)定，以回收率作為準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)指標(biāo)，重復(fù)測(cè)定某一濃度樣品的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)作為精密度評(píng)價(jià)指標(biāo)。每個(gè)樣品做10個(gè)平行，用3批不同試劑進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算回收率及批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

特異性測(cè)定。選擇與紅霉素具有類似結(jié)構(gòu)的硫氰酸紅霉素、琥乙紅霉素、泰樂(lè)菌素、替米考星、螺旋霉素、北里卡星進(jìn)行ELISA測(cè)定，通過(guò)各種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別得到其50%抑制濃度(IC50)，根據(jù)公式：交叉反應(yīng)率(%)=IC50(紅霉素)/IC50(類似物)×100%，計(jì)算試劑盒對(duì)其他藥物的交叉反應(yīng)率，從而反映其特異性。

1.2.5 試劑盒與儀器方法比對(duì)

分別按照高效液相色譜和試劑盒檢測(cè)提供的方法，對(duì)空白水樣進(jìn)行紅霉素添加回收試驗(yàn)，比較兩種方法的回收率和變異系數(shù)(在試劑盒檢測(cè)方法中，隨機(jī)選取3塊酶標(biāo)板，每塊板做4個(gè)平行)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別測(cè)定0 μg/L、0.2 μg/L、0.6 μg/L、1.8 μg/L、5.4 μg/L、16.2 μg/L濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，百分吸光率為縱坐標(biāo)，建立紅霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，同時(shí)建立雙對(duì)數(shù)直線擬合曲線如圖2所示。實(shí)驗(yàn)表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍為0.2～16.2μg/L，IC50為0.6 μg/L；線性方程為y=-2.374x-0.410，相關(guān)系數(shù)R2=0.994，說(shuō)明ELISA試劑盒線性關(guān)系良好。

2.2 檢測(cè)限的測(cè)定

酶聯(lián)免疫試劑盒對(duì)20份空白水樣的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可以看出：本試劑盒對(duì)環(huán)境水樣的檢測(cè)限為1μg/L。

2.3 樣本精密度和準(zhǔn)確度的測(cè)定

按2μg/L、5μg/L兩個(gè)濃度的紅霉素對(duì)環(huán)境水樣進(jìn)行添加回收測(cè)定，平均回收率在70%～110%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確性較高；批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均<10%，說(shuō)明該試劑盒精密度良好。

表1 紅霉素試劑盒檢測(cè)限試驗(yàn)

2.4 特異性的測(cè)定

選擇與紅霉素具有類似結(jié)構(gòu)的硫氰酸紅霉素、琥乙紅霉素、泰樂(lè)菌素、替米考星、螺旋霉素、北里卡星進(jìn)行ELISA測(cè)定，測(cè)得各種藥物的IC50及交叉反應(yīng)率見(jiàn)表2。

表2 紅霉素抗體與其他類似結(jié)構(gòu)藥物交叉反應(yīng)率實(shí)驗(yàn)

由表2可知，由于硫氰酸紅霉素、琥乙紅霉素、紅霉素均屬大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，而硫氰酸紅霉素是紅霉素的硫氰酸鹽，是合成紅霉素的初始原料，琥乙紅霉素是紅霉素的琥珀酸乙酯，因此，硫氰酸紅霉素、琥乙紅霉素的交叉反應(yīng)率較高，分別為114%、67.4%；而泰樂(lè)菌素、替米考星、螺旋霉素、北里卡星的交叉反應(yīng)率均低于0.1%，說(shuō)明試劑盒與其他類似結(jié)構(gòu)藥物無(wú)交叉反應(yīng)，特異性較強(qiáng)。

2.5 試劑盒與儀器方法比對(duì)

以100μg/L濃度對(duì)空白水樣進(jìn)行紅霉素添加回收試驗(yàn)，儀器檢測(cè)方法和試劑盒檢測(cè)方法測(cè)得的回收率和變異系數(shù)見(jiàn)表3。

表3 ELISA試劑盒與儀器方法精密度和準(zhǔn)確度比較結(jié)果

由表3可知，儀器檢測(cè)方法的回收率為82.2%～95.7%，平均回收率為91.1%，變異系數(shù)為6.7%；同樣添加濃度，試劑盒所測(cè)得的回收率為79.8%～100.5%，平均回收率為92.4%，變異系數(shù)為5.5%，說(shuō)明ELISA法與儀器檢測(cè)結(jié)果基本一致，該方法可用于環(huán)境水樣中紅霉素的殘留檢測(cè)。

3 討論

本研究通過(guò)檢測(cè)酶聯(lián)免疫試劑盒的檢測(cè)限、精密度、準(zhǔn)備度、交叉反應(yīng)率等各項(xiàng)技術(shù)參數(shù)，并將其精密度和準(zhǔn)確度與HPLC法做對(duì)比，以評(píng)價(jià)ELISA方法對(duì)環(huán)境水樣中紅霉素殘留的檢測(cè)效果。結(jié)果表明：紅霉素ELISA試劑盒的檢測(cè)限為1μg/L；試劑盒工作范圍為0.2～16.2μg/L；精密度、準(zhǔn)確度結(jié)果與HPLC法一致；且本試劑盒使用方便、前處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)耗時(shí)短(55min)、成本低，適用于現(xiàn)場(chǎng)篩查和水質(zhì)監(jiān)控，可滿足對(duì)環(huán)境水樣中紅霉素殘留的快速檢測(cè)。

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Evaluation on the Detection Effect of Erythromycin Enzyme-linked ImmunosorbentAssay Kit in Environmental Water

LUO Xiao-qin1,2, HAN Shen3, WAN Yu-ping1,2, WANG Pei-yue3, CUI Ting-ting1,2

(1. Beijing Kwinbon Biotechnology Co. Ltd., Beijing 102206, China)

New type of flue-cured tobacco chamber combines air-source heat pump water heater and solar energy heater. The comparative tests were done between new type chamber and old style of auto adding charcoal chamber. The results showed that using new type chamber would save 48.2% of energy. Meanwhile, the economic benefits would be 115 Yuan, which was higher than the old style chamber. Some constructive suggestions were put forward in order to popularize the new technology, Such as controlling the cost and popularizing it region by region on purpose of constructing the infrastructure.

flue-cured tobacco; flue-cured; new energy; energy saving; the South of Anhui

2017-02-16

北京市科技計(jì)劃課題(Z151100002115059)。

羅曉琴(1984-)，女，副高級(jí)工程師，本科，主要從事食品安全快速檢測(cè)工作。

萬(wàn)宇平。

X832

A

1673-9655(2017)04-0072-04