液相色譜-柱后衍生-原子熒光聯用測定8種砷化合物

張奕寧，章寒英，趙紅波，楊 洋，方振宇

（1.浙江公正檢驗中心有限公司，浙江杭州 311305；2.贊宇科技集團股份有限公司，浙江杭州 310030）

液相色譜-柱后衍生-原子熒光聯用測定8種砷化合物

張奕寧1，2，章寒英1，2，趙紅波1，2，楊 洋1，2，方振宇1，2

（1.浙江公正檢驗中心有限公司，浙江杭州 311305；2.贊宇科技集團股份有限公司，浙江杭州 310030）

應用高效液相色譜-柱后衍生-原子熒光光譜聯用法，建立了食品和飼料中三價砷、五價砷、一甲基胂酸、二甲基胂酸、洛克沙胂、4-氨基 -苯胂酸、4-硝基 -苯胂酸、4-羥基 -苯胂酸8種食品和飼料中比較常見的砷化合物的檢測方法。樣品通過稀硝酸熱浸提后，用正己烷脫脂凈化，通過漢密爾頓 PRP-X100 陰離子交換柱或 CNW Athena C18 色譜柱分離，在無機砷化合物10～40μg/L，有機砷化合物 20～600μg/L 濃度內線性良好，相關系數大于 0.99，在無機砷添加 10μg/L、20μg/L，有機砷化合物添加 20～300μg/L 的添加水平下，平均回收率 80.3%～101.3%，相對標準偏差小于 5%，檢測限 0.001～0.07 mg/kg。該方法簡單、快速、準確，并兼顧了 GB 5009.11-2014 中對于無機砷檢測的需求。

液相色譜—柱后衍生—原子熒光；聯用；砷化合物；食品及飼料

現代醫學的研究認為，砷劑的毒性與其化學形態關系極大。WTO 分別于1978年、1980年、1982年確認無機砷屬于第一類致癌物。而與無機砷不同的是，自然界天然合成的一系列有機砷化合物以及人類合成的一些有機砷藥劑則具有較小的毒性和致癌性，如4-氨基 -苯胂酸、4-羥基 -苯胂酸、4-硝基 -苯胂酸、洛克沙胂（3-硝基 -4-羥基 -苯胂酸）等在農業上是效果很好的禽類抗病制劑。藻類、瓣鰓綱、十足目，則或因自身合成，或因食物鏈，則造成了一甲基胂酸、二甲基胂酸、胂糖、胂膽堿、胂甜菜堿等有機砷化合物較高的含量所以在對于食品中的砷的含量水平很早就進入了形態分析的概念。

本方法應用高效液相色譜 -柱后衍生 -原子熒光光譜聯用法，通過優化色譜條件和前處理方式，建立了食品和飼料中三價砷、五價砷、一甲基胂酸、二甲基胂酸、洛克沙胂、4-氨基 -苯胂酸、4-硝基 -苯胂酸、4-羥基 -苯胂酸8種食品和飼料中比較常見的砷化合物的檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 設備

北京吉天 SP-20形態分析儀 -聯用原子熒光主機 AFS8220。色 譜柱 ：漢密爾頓陰離子交換柱 PRP-X100（含 保護柱）、CNW Athena C18 色譜柱（含保護柱）。奧豪斯 AR224CN 分析天平。上海安亭 TDL-40B 離心機。超聲水浴。抽濾設備。海能 SH230N 消解爐。milli-Q 純水儀。

1.1.2 試劑

硝酸，優級純。硼氫化鈉，分析純。過硫酸鉀，分析純。氫氧化鈉，分析純。磷酸氫二銨，分析純。甲醇，色譜純。乙酸銨，分析純。

1.1.3 標準物質

三價砷標準溶液 ：生產公司 inorganic ventures，砷濃度1 000±5μg/mL。五價砷標準溶液 ：生產公司 O2SI，砷濃度1 000±3μg/mL。一甲基胂酸標準溶液（GBW08668）：生產公司中國計量科學研究院，濃度 0.335μmol/g。二甲基胂酸標準溶液（GBW08669）：生產公司中國計量科學研究院，濃度 0.233μmol/g。4- 氨 基 - 苯 胂 酸 ：Dr.Ehrenstorfer 生 產， 含量 99%。4-羥 基 -苯 胂 酸 ：CNW 生 產， 含 量 ＞98%。4-硝基 - 苯 胂 酸 ：Dr.Ehrenstorfer 生 產， 含 量 99%。 洛 克 沙 胂 ：Dr.Ehrenstorfer 生產，含量 99%。

各標準物質分別配置成5μg/mL 左右的水溶液，于4℃中避光保存。用水配置成不同濃度系列的標準工作溶液。

1.2 實驗條件

1.2.1 樣品前處理

稱取 2g 經粉碎后的試樣加入 20mL 1%（V/V）硝酸，于90℃加熱 2.5h，期間每 30min 搖勻一次。樣液冷卻后于 3 000r/ min 離心5min 后取上清液，用正己烷10mL 脫脂2次。用0.45μm有機濾頭濾入進樣瓶中封裝。

1.2.2 色譜條件

（1） 陰離子交換液相色譜（適用于測定三價砷、二甲基胂酸、一甲基胂酸、4-氨基 -苯胂酸、五價砷、4-羥基 -苯胂酸、洛克沙胂）。

色譜柱 ：漢密爾頓陰離子交換柱 PRP-X100（含保護柱）。

進樣量 ：滿環（100μL）。

流動相 A ：8 mmol/L 磷酸氫二銨水溶液。

流動相 B ：320 mmol/L 磷酸氫二銨水溶液。

（2） C18柱交換液相色譜（適用于測定4-硝基 -苯胂酸）。

色譜柱 ：CNW Athena C18 色譜柱（含保護柱）。

進樣量 ：滿環（100μL）。

流動相 A ：20mmol/L 乙酸銨水溶液。

流動相B：甲醇。

B% ：12%（0min）→ 12%（32min）

1.2.3 儀器測定條件與柱后衍生條件

原子熒光條件 ：載氣流量 300mL/min，屏蔽氣 500mL/min，光電倍增管負高壓300V，總電流80mA，輔電流35mA。

衍生條件：

紫外燈在線消解開啟。

衍生劑 1：1% 過硫酸鉀 -0.35% 氫氧化鈉溶液（300mL/h）。

衍生劑2 ：7% 硝酸載流溶液（500mL/h）。

衍生劑3 ：空氣（300mL/h）。

衍 生 劑 4 ：4% 硼 氫 化 鈉 -0.35% 氫 氧 化 鈉 還 原 劑 溶 液（300mL/h）。

2 結果與討論

2.1 提取的優化

測定這8種砷化合物。通過對1% 硝酸溶液熱提取、10%硝酸溶液熱提取、1% 鹽酸溶液熱提取等方法進行了比較，1%硝酸提取作為前處理方式引入的砷背景含量最低，而且提取效果較好，且不易造成砷化合物之間的轉化。

2.2 色譜條件的優化

由于三價砷（亞砷酸根）、五價砷（砷酸根）極性很強，所以本方法采用了參考國標無機砷的做法，采用陰離子交換柱的方式分離。采用由低到高的磷酸鹽濃度梯度洗脫，使7種砷化合物能夠在25min 內出峰完全。

在實驗中發現，漢密爾頓 PRP-X100陰離子交換柱在磷酸氫二銨作為流動相進行洗脫時，對含硝基的化合物有很強的吸附性。洛克沙胂（3-硝基 -4-羥基 -苯胂酸）在該320mmol/ L 磷酸氫二銨洗脫近 10min 才出峰，而 4-硝基 -苯胂酸用320mmol/L 磷酸氫二銨洗脫超過 40min 依然沒有出峰。

改用 C18色譜柱，則三價砷、五價砷無法分開。因此采用陰離子交換柱為主，測定7種砷化合物，用 C18交換柱單獨測定4-硝基 -苯胂酸的方式進行測定。

2.3 儀器條件的優化

儀器條件主要通過調節光電倍增管電壓、燈電流的方式改變衍生條件，以改變不同砷化合物的響應能力。根據實驗，在不使用紫外燈在線消解、僅僅使用7% 硝酸載流溶液與4%硼氫化鈉 -0.35% 氫氧化鈉還原劑溶液進行衍生時，只能測出三價砷、二甲基胂酸、一甲基胂酸、五價砷，其余四種砷化合物完全沒有響應。使用紫外燈在線消解、使用7%硝酸載流溶液、4% 硼氫化鈉 -0.35% 氫氧化鈉還原劑溶液、空氣、水進行衍生時，三價砷、二甲基胂酸、一甲基胂酸、五價砷信號沒有變化，而其余四種砷化合物只能獲得很低的響應強度。故最終采用了 1.2.3 中所提的儀器測定的相關條件。

以陰離子交換柱進行測定，各物質出峰時間為：三價砷 2.89min， 二 甲 基 胂 酸 4.16min， 一 甲 基 胂 酸 6.05min，4-氨 基 - 苯 胂 酸 10.54min， 五 價 砷 11.40min，4- 羥 基 - 苯 胂 酸12.80min，洛克沙胂 20.30min。以 C18 柱進行分離，4- 硝基 -苯胂酸出峰 11.42min。

2.4 線性關系及檢出限的考察

在本文所確定的測定條件下，對該8種化合物進行測定。以保留時間進行定性，以響應峰面積進行定量。用濃度和對應的響應峰面積進行線性回歸，所得線性范圍及檢出限如下：

三價砷（As 計），線性范圍 0～40.0μg/L，工作曲線方程I=4 371.3 * C-4 580.9，線性度 0.997 756，方法檢出限 0.009 41

mg/kg。二甲基胂酸，線性范圍 0～78.0μg/L，工作曲線方程I=2 924.1 * C+946.9， 線 性 度 0.999 299， 方 法 檢 出 限 0.01486 mg/kg。一甲基胂酸，線性范圍 0～80.4μg/L，工作曲線方程I=3 028.3 * C-13 297.9，線性度 0.993 310，方法檢出限 0.012 65 mg/kg。4- 氨基 - 苯胂酸，線性范圍 0～257.6μg/L，工作曲線方 程 I=1 061.6 * C-16 427.6， 線 性 度 0.992 470， 方 法 檢 出 限0.038 38mg/kg。 五 價 砷（As 計 ）， 線 性 范 圍 0～40.0μg/L， 工作曲線方程 I=4 911.3 * C-104 48.6，線性度 0.993 538，方法檢出限 0.008 88mg/kg。4- 羥基 - 苯胂酸，線性范圍 0～260.8μg/L，工作曲線方程 I=1 402.8 * C-21 057.2，線性度 0.991 618，方法檢出限 0.032 59mg/kg。洛克沙胂，線性范圍 0～600.0μg/L，工作曲線方程 I=658.9 * C-23 602.5，線性度 0.992 042，方法檢出限 0.062 40 mg/kg。4- 硝基 - 苯胂酸，線性范圍 0～252.8μg/L，工作曲線方程 I=1 912.9 * C-11 485.9，線性度 0.998 618，方法檢出限 0.024 85mg/kg。

2.5 方法回收率及精密度驗證

對陰性樣品進行3次濃度加標回收率實驗，考察回收率及精密度，結果如下：

三價砷（As 計），加標濃度 1.00/10/20μg/L，回收率 86.6%/ 91.1%/96.6%，RSD 2.8%～3.5%。二甲基胂酸，加標濃度1.95/19.5/ 39μg/L， 回 收 率 82.1%/92.1%/98.1%，RSD 2.5%～2.8%。一 甲 基 胂 酸， 加 標 濃 度 2.01/20.1/40.2μg/L， 回 收 率80.3%/90%/96.7%，RSD 3.0%～3.7%。4- 氨 基 - 苯 胂 酸， 加標 濃 度 6.44/64.4/128.8μg/L， 回 收 率 91.6%/94.4%/95.8%，RSD 3.3%～3.8%。五 價 砷（As 計），加 標 濃 度 1.00/10/20μg/ L， 回 收 率 95.7%/98.2%/101.3%，RSD 2.0～2.8%。4- 羥基 - 苯 胂 酸， 加 標 濃 度 6.52/65.2/195.6μg/L， 回 收 率 83.3%/ 92.5%/98.2%，RSD 2.9%～3.3%。 洛 克 沙 胂， 加 標 濃 度7.5/150/30μg/L， 回 收 率 81.1/91.1/98.5%，RSD 3.8%～3.9%。4- 硝 基 - 苯 胂 酸， 加 標 濃 度 3.16/63.2/126.4μg/L， 回 收 率80.5%/92.8%/98.6%，RSD 2.1%～3.0%。

可見平均回收率 80.3%～101.3%，相對標準偏差小于 5%，具有較高的準確度和精密度。

對陽性飼料樣品（總砷 5.2mg/kg）進行測定，結果為三價砷（As 計）0.590mg/kg，4-氨基 -苯胂酸 1.45mg/kg。

3 結論

本文建立并優化了三價砷、五價砷、一甲基胂酸、二甲基胂酸、洛克沙胂、4-氨基 -苯胂酸、4-硝基 -苯胂酸、4-羥基-苯胂酸的測定方法。該方法有效測定范圍內線性良好，檢出限為 0.001-0.07mg/kg， 精 密 度 為 2.5%～3.9%， 回 收率在80.3%～101.3%，具有較高的準確度和精密度。

[1] GB 5009.11-2014，食品安全國家標準 食品中總砷及無機砷的測定[S].

Determination of 8 Arsenic Compounds by LC-AFS

Zhang Yi-ning，Zhang Han-ying，Zhao Hong-bo，Yang Yang，Fang Zhen-yu

A method for the detection of trivalent arsenic，pentavalent arsenic，MMA，DMA，loxacridone，4-amino-arsenic，4-nitro-phenylarsine acid，4-hydroxy-phenylarsinic acid in food and feed were established by LC-AFS.The samples were purif i ed by dilute nitric acid and then degreased with n-hexane，separated by Hamilton PRP-X100 chromatographic column or CNW Athena C18 chromatographic column.The inorganic arsenic compound was 10-40 μg/L，the organic arsenic compound 20-600 μg/L.The average recoveries were 80.3-101.3%，the relative standard deviations were less than 5%，The method is simple，rapid and accurate，and takes into account the demand for inorganic arsenic detection in GB 5009.11-2014.

LC-AFS ；arsenic compound ；food and feed

TS210.7

：B

：1003–6490（2017）07–0182–02

2017–05–22

張奕寧（1989—），男，浙江杭州人，助理工程師，主要研究方向為化學分析。