重視分子病理診斷新技術提高結核病病理學診斷水平

車南穎

中國是結核病高負擔國家，在結核病診斷中面臨很多問題。分析2018年WHO發(fā)布的全球結核病報告[1]，中國結核病診斷在以下3個方面需要繼續(xù)加強：(1)肺結核細菌學確診率低，僅為31%，遠低于世界平均水平57%；(2)耐藥結核病發(fā)現率低，不到20%耐多藥或利福平耐藥患者被發(fā)現；(3)肺外結核發(fā)現率低，全球報告的結核病患者中15%為肺外結核，但中國報告的肺外結核患者僅占5%。

病理學是診斷結核病的重要途徑，在疑難性結核病，尤其在菌陰肺結核(痰涂片及培養(yǎng)陰性)及肺外結核的診斷中發(fā)揮著非常重要的作用。近年來，分子病理學新技術發(fā)展迅猛，結合傳統(tǒng)病理學可以做到確診結核病、鑒別診斷結核病與非結核分枝桿菌病，以及診斷耐藥結核病，為解決以上3個結核病診斷所遇到的突出問題提供了新的途徑。如何將這些新技術應用到臨床實際工作中，提高疑難性結核病的診斷水平是擺在我們面前的重要問題。

病理學診斷結核病的方法及標準

一、病理學診斷結核病的主要方法

病理學診斷結核病的主要方法包括常規(guī)病理學、特殊染色、免疫組織化學染色，以及分子病理學等。2017年發(fā)表的《中國結核病病理學診斷專家共識》[2](以下簡稱“《共識》”)，對上述4種方法的原理、特點及注意事項等做了詳細的介紹。

1. 常規(guī)病理學：常規(guī)病理學通過大體和鏡下觀察組織細胞的病理形態(tài)學變化進行診斷，具有針對性強、準確性高等特點。對結核病與其他一些非肉芽腫性疾病(如肺結核與肺癌)的鑒別診斷具有很好的優(yōu)勢。但肉芽腫或壞死等結核病常見的病理改變亦可出現在其他感染性和非感染性肉芽腫性病變中[3-4]，《共識》中明確指出常規(guī)病理學診斷手段不能作為診斷結核病的金標準，必須通過其他方法找到明確的結核病病原學依據方可確診。

2. 特殊染色：特殊染色中，抗酸染色是病理科最為常用的查找抗酸桿菌的方法，對于診斷結核病有非常重要的作用。需要注意的是，抗酸染色無法鑒別結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌，而且除了分枝桿菌外其他一些種屬的細菌也可呈抗酸染色陽性[5]，因此抗酸染色陽性并不能確診結核病，形態(tài)典型的情況下只能診斷分枝桿菌病。真菌病是除了分枝桿菌病以外最為常見的感染性肉芽腫性疾病。如果僅憑常規(guī)病理，有時這兩類疾病容易誤診，因此《共識》建議將抗酸染色和真菌染色作為感染性肉芽腫性疾病鑒別的常規(guī)項目開展。真菌染色中六胺銀(Grocott’s methenamine silver，GMS)染色和過碘酸希夫染色(periodic acid-Schiff stain，PAS染色)是最常用的識別真菌的染色方法[6]。

3. 免疫組織化學染色：免疫組織化學染色是病理科非常常見的技術，但在結核病診斷中應用不多，主要原因是沒有可以應用于臨床的商業(yè)化一抗。但最近的研究表明，免疫組織化學檢查操作簡便，陽性信號易于觀察，不需要使用油鏡，可以有效地提高檢測敏感度和工作效率[7-8]。因此，《共識》建議未來開展更多的臨床轉化及評估研究。

4. 分子病理學：分子病理學診斷技術發(fā)展迅速。基于基因檢測的分子病理學新技術具有準確、快捷等優(yōu)點，可有效提高組織標本中結核分枝桿菌的檢出率[9-10]，可幫助鑒別結核病與非結核分枝桿菌病[11]，還可以幫助診斷耐藥結核病[12]，為結核病病理學精準診斷提供了更多的輔助手段。目前，臨床上常用的技術有實時熒光定量PCR、核酸分子雜交技術，以及熒光PCR探針熔解曲線法等[2]。

二、 病理學診斷結核病的標準

2018年開始實施的新的《肺結核診斷》衛(wèi)生行業(yè)標準[13]中首次將病理學作為確診依據。這也進一步說明了病理學在結核病診斷中的重要地位。為了讓臨床醫(yī)師更加了解結核病病理學診斷內涵，同時規(guī)范結核病病理學診斷報告，2017年發(fā)表的《共識》中明確規(guī)定了結核病病理學診斷標準[2]。根據中華醫(yī)學會編著的《臨床技術操作規(guī)范：病理學分冊》所規(guī)定的病理學診斷基本類型，結核病診斷也分為4個級別：(1)Ⅰ類診斷屬于明確診斷，主要有2個因素，即形態(tài)學符合并且找到結核分枝桿菌復合群病原學證據。(2)Ⅱ類診斷屬于提示性診斷，即形態(tài)學符合，但是并沒有明確的結核病病原學依據。(3)Ⅲ類診斷屬于描述性診斷，病變組織或細胞不足以提示診斷為結核病，只能進行病變的形態(tài)描述。(4)Ⅳ類診斷為無法診斷[14]。

Ⅰ類診斷標準明確了在傳統(tǒng)的形態(tài)學基礎上必須要有病原學依據。如果僅有常規(guī)病理學或特殊染色結果，診斷級別只能到Ⅱ類，只有通過分子病理學或微生物學獲得病原學依據，才能達到Ⅰ類診斷級別。沒有應用分子病理學技術的病理科按照《共識》規(guī)定可以出具Ⅱ類及以下級別的病理診斷報告。《共識》建議有條件的病理科積極開展分子病理學診斷工作，以提高結核病病理學診斷水平。

結核病病理學診斷現狀及存在問題

結核病病理學研究在19世紀80年代至20世紀50年代非常活躍。當時，結核病在全球的流行率高、死亡率高，受到醫(yī)學界的重視。通過尸檢和組織病理學方法，觀察研究不同類型的結核病病理形態(tài)改變，提出了很多結核病發(fā)病機制及診斷相關的觀點。但在1950年前后抗結核藥物陸續(xù)出現，結核病的治療逐漸轉變?yōu)閮瓤扑幬镏委熌Ｊ剑饪剖中g逐漸減少，能獲取的人體組織標本越來越少，影響了依靠形態(tài)學的結核病組織病理學的研究。隨著20世紀末，結核病卷土重來，尤其是耐藥結核病等難治性結核病的出現，結核病診治新技術的研究與開發(fā)再一次受到重視。近年來分子病理技術發(fā)展迅速，結合傳統(tǒng)病理學，結核病病理學診斷從組織細胞學水平發(fā)展到生物大分子水平，其診斷敏感度和準確性都得到了顯著的提高。同時，微創(chuàng)技術，如CT引導下的經皮肺穿刺、支氣管活檢及超聲引導下的針吸活檢等技術的發(fā)展，使得疑難性結核病患者可以通過安全、快速、方便的途徑獲得組織標本。因此，病理學在菌陰肺結核及肺外結核的確診中發(fā)揮著越來越重要的作用[15]。

雖然分子病理技術發(fā)展迅速，但是結核病病理診斷目前多以傳統(tǒng)的常規(guī)病理和抗酸染色手段為主，只有少數高級別醫(yī)院在開展結核病分子病理學診斷工作。中國結核病病理學診斷面臨著以下幾個問題。

一、結核病專科醫(yī)院病理科基礎薄弱、人員緊缺

病理學主要研究疾病的原因，以及疾病發(fā)生、發(fā)展過程和預后，是連接基礎醫(yī)學與臨床醫(yī)學的橋梁，在醫(yī)學診斷和研究中占有重要地位。但是，很多結核病專科醫(yī)院沒有重視病理學科的發(fā)展，普遍存在病理科人員緊缺、設備陳舊、學科發(fā)展滯后，以及科室設置不合理等問題。2015年中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會(簡稱“國家衛(wèi)計委”)發(fā)布的《病理專業(yè)醫(yī)療質量控制指標(2015年版)》[16]中明確指出，病理科每百張病床應至少配備1名病理醫(yī)師和1名病理技師。但是，大多數專科醫(yī)院都達不到此項標準。很多專科醫(yī)院甚至沒有病理科的設置，沒有病理科醫(yī)師。結核病專科醫(yī)院亟需重視病理學科發(fā)展，重視人才培養(yǎng)，改善工作環(huán)境，更新儀器設備。

二、結核病分子病理學實驗室缺乏專業(yè)化建設

近年來，分子病理學發(fā)展非常迅速，可以為病理學確診結核病、鑒別診斷結核病與非結核分枝桿菌病、診斷耐藥結核病提供至關重要的依據。但是，除了少數幾家大型結核病專科醫(yī)院外，很多專科醫(yī)院還沒有開展結核病分子病理學診斷工作。

分子病理實驗室的建設要求與傳統(tǒng)病理實驗室有很大區(qū)別，主要體現在3個方面：(1)建立符合標準的分子病理學實驗室；(2)必須有掌握分子病理學基本知識的、具有開展PCR臨床檢測審核資質的專業(yè)醫(yī)師及技術人員；(3)配備符合分子病理學實驗要求的專業(yè)設備。場地、人員、設備是開展分子病理學診斷工作最基本的條件。因此，專科醫(yī)院在病理科建設和發(fā)展中不僅應該重視傳統(tǒng)病理學的發(fā)展，在條件允許的情況下也要考慮分子病理學的同步發(fā)展，應該在專業(yè)實驗室建立、專業(yè)人才培養(yǎng)、專業(yè)化管理方面多做工作。

三、結核病病理學診斷的質量控制體系亟待完善

2004年《臨床技術操作規(guī)范：病理學分冊》[14]出版，是我國第一部病理科技術操作方面的規(guī)范，主要包括病理學檢查常規(guī)、基本技術操作及相關技術操作。2009年中華人民共和國衛(wèi)生部頒布了《病理科建設與管理指南(試行)》[17]，主要對執(zhí)業(yè)條件、質量控制、安全管理、監(jiān)督管理等方面做了規(guī)范。該指南在病理科場所、設施、設備及人員方面提出了明確的基本要求。2015年，國家衛(wèi)生和計劃生育委員會頒布了《病理專業(yè)醫(yī)療質量控制指標(2015年版)》(簡稱《質量控制指標》)[15]；其中包括了13項內容：每百張病床病理學醫(yī)師數、每百張病床病理學技術人員數、標本規(guī)范化固定率、HE染色切片優(yōu)良率、免疫組織化學染色切片優(yōu)良率、術中快速病理學診斷及時率、組織病理學診斷及時率、細胞病理學診斷及時率、各項分子病理學診斷室內質量控制合格率、免疫組化染色室間質量評價合格率、各項分子病理學檢查室間質量評價合格率、細胞病理學診斷質量控制符合率、術中快速診斷與石蠟診斷符合率。該《質量控制指標》貼近病理科日常工作，從人員配置，主要診斷工作的重要環(huán)節(jié)、技術要求及質量控制等方面做了明確的說明。同年，《分子病理診斷實驗室建設指南(試行)》[18]發(fā)表，建議三級甲等醫(yī)院病理科應設置分子病理學診斷實驗室，并且在醫(yī)院準入、人員準入、實驗室設置要求、實驗室生物安全、檢測項目準入、質量保證和質量控制、試劑盒消耗品準入和管理、報告格式和內容、分子病理學診斷實驗室管理等9個方面給出了指導性參考意見[18]。結核病專科醫(yī)院病理科建設也應該按照上述指南和規(guī)范，做好病理科的各項質量控制工作。同時，應該發(fā)揮結核病專科醫(yī)院的特點，在實際工作中建立具有結核病專業(yè)特色的質量控制體系。但是，目前無論是國家層面還是專科系統(tǒng)內都沒有針對結核病病理學相關的質量控制標準。如抗酸染色、結核病分子病理學及結核病免疫組織化學染色等都需要進行室內質量控制和室間質量評價工作，但這些工作目前都存在嚴重不足。未來，結核病病理學需要建立健全的質量控制體系，以保證和提高結核病病理學診斷的質量，為結核病診治與防控提供有力保障。

展 望

分子病理學作為結核病確診的重要途徑，可為難以獲得細菌學證據的疑難性結核病的診斷提供結核分枝桿菌病原學依據，還可以提供病原菌的基因型藥敏試驗結果。隨著“精準醫(yī)學”理念的發(fā)展，結核病的診治模式也在逐漸發(fā)生變化。目前，從傳統(tǒng)經驗醫(yī)學的模式越來越多地采用循證醫(yī)學觀念，并向精準醫(yī)學時代邁進。實現結核病的精準治療，建立個體化的治療方案是我們的愿景。分子病理學新技術的推廣和普及，勢必促進結核病診斷水平更上一層樓，成為結核病精準治療不可或缺的診斷手段。未來，結核病病理學不僅要做好傳統(tǒng)病理學的基礎工作，還應該加快步伐推進分子病理學專業(yè)化建設、人才隊伍建設，以及加快和完善質量控制體系建設，以適應結核病防治事業(yè)發(fā)展的需要。