不同分子量殼聚糖對高脂膳食小鼠血糖的調節作用

張思聰 - 夏文水 - 王 斌,3 ,3 楊 碩

(1. 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2. 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3. 江蘇海隆國際貿易有限公司，江蘇 淮安 223005)

不同分子量殼聚糖對高脂膳食小鼠血糖的調節作用

張思聰1,2ZHANGSi-cong1,2夏文水1,2XIAWen-shui1,2王 斌1,2,3WANGBin1,2,3楊 碩1,2YANGShuo1,2

(1. 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2. 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3. 江蘇海隆國際貿易有限公司，江蘇 淮安 223005)

為研究不同分子量殼聚糖對高脂膳食小鼠血糖的調節作用，選取C57BL/6J雄性小鼠48只，隨機分為4組：正常組(Control)、高脂組(high fat，HF)、低分子量殼聚糖組(high fat+low weight molecular chitosan， HF+LWMC)和高分子量殼聚糖組(high fat+high weight molecular chitosan，HF+HWMC)。每周記錄其攝食量和體重。飼養16周后，對小鼠血清、肝臟的生化指標進行測定，并對肝臟磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate carboxybinase，PEPCK)及葡萄糖-6-磷酸酶(Glucose 6 phosphatase，G6Pase)的基因表達進行檢測。結果表明：殼聚糖的添加可降低高脂膳食小鼠的體重和血脂水平，緩解肝臟脂質過氧化，高分子量殼聚糖的效果略好于低分子量殼聚糖。

殼聚糖；高脂膳食；降血糖

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是由多種致病因素引起的一種以慢性高血糖為特征的代謝紊亂綜合征，現已逐漸發展為全世界嚴重的公共衛生問題，成為人類疾病的第三位死亡病癥。糖脂代謝紊亂在Ⅱ型糖尿病的發生與發展中起重要作用，而且糖、脂代謝紊亂常?；ハ嘤绊?，形成惡性循環[1]。肥胖是一些慢性疾病的主要病因，易導致血脂異常、肝脂肪變性和Ⅱ型糖尿病等疾病[2]。一些研究[3-5]發現肥胖和Ⅱ型糖尿病的易致病基因與環境因素有一定關系。預計在2010～2030年，發展中國家的糖尿病成年人患病者會增加69%，發達國家會增加20%[6]。用于輔助治療糖尿病的藥物或多或少帶有副作用，促使人們尋找高效的天然活性成分。殼聚糖(chitosan，CS)是天然多糖中唯一的陽離子聚合多糖，是一種豐富的可再生資源[7-9]，主要存在于貝類、蛤、牡蠣、磷蝦和真菌中[10-11]，因其具有一些獨特的生物活性[12-15]，被廣泛應用于生物醫藥、食品工程等領域[16-18]。據報道[19-20]，殼聚糖可以在腸胃中形成膠狀黏性纖維，延緩胃排空，降低糖吸收速度，增加周圍組織對胰島素的敏感性。目前已發現殼聚糖具有降血脂、降血糖等生物學功能[21]，但其具體機制尚不完全清楚，且大部分試驗采用STZ造模，并沒有完全模仿人們的膳食習慣。本研究擬通過給小鼠攝食不同分子量殼聚糖，比較分析LWMC和HWMC對小鼠生化指標及基因表達的影響，探討不同分子量殼聚糖對小鼠血糖調節的影響，進一步探討殼聚糖對高脂膳食機體的氧化還原狀態、糖異生水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

殼聚糖：平均分子量分別為48，510 kDa，浙江金殼生物化學有限公司；

總抗氧化能力(T-AOC)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、胰島素試劑盒：南京建成生物工程研究所；

Oligo(GAPDH、PEPCK、G6Pase)：上海桑尼生物科技有限公司，引物序列見表1；

Prime ScriptTMRT Master Mix、SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒：寶生物工程 (大連) 有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

冷凍型大容量離心機：4K15型，德國Sigma公司；

紫外可見分光光度計：UV-1800型，日本島津公司；

血糖儀：ACCU-CHEK Active型，羅氏診斷產品(上海)有限公司；

酶標儀：M5型，美國Molecular Devices公司；

表1 RT-qPCR引物序列?Table 1 The sequence of the primers for RT-qPCR

? F: Forward primer 正向引物；R: Reversed primer 反向引物。

One-drop spectrophotometer：OD-1000型，上海采邑生物科技有限公司；

實時熒光定量PCR儀：Step One Plus型，美國應用生物系統公司。

1.2 動物試驗設計

取4周齡C57BL/6J雄性小鼠48只，預飼養7 d后，根據體重隨機分為4組：對照組(Control，D12450B)，高脂組(HF，D12451)，高脂+低分子量殼聚糖組(HF+LWMC)，高脂+高分子量殼聚糖組(HF+HWMC)，殼聚糖均添加于飼料中。D12405B、D12451飼料配方見表2。小鼠自由進食進水。每周對小鼠體重進行記錄，并對其飲水量及進食量進行記錄和分析，每4周對其血糖水平進行測定。環境溫度控制在(22±2) ℃，濕度60%，小鼠飼養16周后處死。

表2 正常、高脂飼料配方?Table 2 Compositions of control and high-fat diet g

? a. 礦物質混合物S10026(g/kg混合物)：氯化鈉259，氯化鎂 41.9，七水合硫酸鎂257.6，四水合鉬酸銨 0.3，硫酸鉻鉀 1.925，碳酸銅 1.05，檸檬酸鐵 21，碳酸錳 12.25，碘酸鉀 0.035，氟化鈉 0.2，亞硒酸鈉 0.025，碳酸鋅 5.6。 b. 維生素混合物V10001(g/kg混合物)：維生素A 11.07，維生素D 9，維生素E 90，維生素K33.774，維生素H 9，維生素B120.9，維生素B 1.8，煙酸 27，泛酸鈣 14.4，維生素B66.3，維生素B26.75，維生素B15.4。

1.3 血液及組織樣本的采集

小鼠飼養16周后禁食12 h，乙醚麻醉后摘眼球取血，所得血液于4 ℃、4 000 r/min條件下離心10 min，取上層血清-80 ℃保存待用。斷頸處死小鼠后，取肝臟等組織在預冷的生理鹽水中漂洗除去附著的血液，濾紙吸干后稱重，所得組織保存于-80 ℃備用。

1.4 指標的檢測

1.4.1 血糖的檢測 在第0、4、8、12、16周時，小鼠隔夜禁食12 h，對其尾部取血，測定其血糖含量。

1.4.2 血清和肝臟組織中指標的測定 使用試劑盒測定血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、胰島素含量以及肝臟中總抗氧化能力(T-AOC)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量。

1.4.3 肝臟中RNA的提取 取100 mg肝臟組織置于1 mL Trizol中，對肝臟組織進行破碎，加200 μL氯仿震蕩，靜置；12 000 r/min，4 ℃下離心15 min，取上清200 μL，加異丙醇200 μL震蕩，靜置5 min；12 000 r/min，4 ℃下離心15 min，棄上清，加入100%乙醇1 mL，12 000 r/min，4 ℃下離心7 min，棄上清后再加入75%乙醇1 mL，12 000 r/min，4 ℃下離心7 min，棄上清；加入DEPC水50 μL，待完全溶解后，使用one-drop spectrophotometer測定RNA濃度。

1.4.4 qRT-PCR 按照試劑盒說明書，將提取的RNA反轉錄為cDNA，使用SYBR Green Mix進行基因擴增檢測，其擴增程序為：95 ℃變性30 s；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min為第一個循環，共40個循環。檢測各模板的Ct值，并通過其進行相對定量分析。

1.4.5 數據處理與統計分析 運用SPSS 17.0軟件進行數據的顯著性檢驗分析，結果以means±SD表示。

2 結果與分析

2.1 對高脂膳食小鼠體重和攝食量的影響

由表3可知，飼養前各組小鼠之間體重無顯著性差異，試驗結束時高脂組小鼠體重有顯著的增加(P<0.05)。而在整個飼養過程中，各組小鼠的攝食量并不存在顯著性差異，即高脂飼料并未引起小鼠攝食量的變化，由此可以說明高脂飼料組中小鼠體重的增加是由于高脂飼料中脂肪含量的增加引起的，與攝食量無直接關系。與高脂組比，高分子量殼聚糖組小鼠體重的差異性強于低分子量殼聚糖組。含殼聚糖組小鼠體重增加量均顯著低于高脂組小鼠。高脂組小鼠的食物效應率顯著高于其他組(P<0.05)。高分子量殼聚糖在減少體重和降低食物效應率方面的作用略好于低分子量殼聚糖。

2.2 對高脂膳食小鼠血糖的影響

由表4可知，飼養前各組小鼠血糖水平差異不大。在飼養期間，正常組血糖水平一直較穩定，高脂組小鼠血糖持續增加，12周開始較正常組顯著增加(P<0.05)。含殼聚糖組小鼠的血糖較正常組也有緩慢上升，但增加速度與高脂組相比較為緩慢。說明高脂膳食致小鼠血糖調節受損，血糖升高，從而引起糖代謝紊亂。由試驗結果可知殼聚糖對高脂膳食小鼠的血糖有降低作用。高分子量殼聚糖對血糖的調節作用略好于低分子量殼聚糖。

2.3 對高脂膳食小鼠血脂和胰島素水平的影響

由表5可知，與正常組相比，高脂組的TC、LDL-C水平顯著升高(P<0.05)，HDL-C水平顯著降低。與高脂組相比，高分子量殼聚糖組的TC含量有明顯降低。殼聚糖組的LDL-C，HDL-C水平均與高脂組有顯著性差異(P<0.05)。4組的TG水平無顯著差異。殼聚糖組的胰島素含量較高脂組顯著升高(P<0.05)。

高脂組小鼠血脂水平增加，殼聚糖可降低血脂水平，減少肝臟脂質過氧化水平，緩解肝臟脂肪變性。高脂膳食導致血清中TC水平升高，殼聚糖組TC、TG含量較高脂組有所降低，但對TG含量的降低作用沒統計學意義。這與殼聚糖具有抗肥胖、降低血脂作用相吻合。同時，高分子量殼聚糖的氧化還原指標略優于低分子量殼聚糖。

表3 不同分子量殼聚糖對高脂膳食小鼠體重和攝食量的影響?Table 3 Effects of chitosan with different molecular weight on the body weight and the diet intake of high-fat diet fed mice (n=8)

? *表示與正常組比較，P<0.05；#表示與高脂組比較，P<0.05；食物效應率為體重增加量與攝食量的比值。表4 不同分子量殼聚糖對高脂膳食小鼠血糖水平的影響?Table 4 Effects of chitosan with different molecular weight on the blood glucose of high-fat diet fed mice (n=8) mmol/L

? *表示與正常組比較，P<0.05；#表示與高脂組比較，P<0.05。

表5 不同分子量殼聚糖對高脂膳食小鼠血脂和胰島素的影響?Table 5 Effects of chitosan with different molecular weight on the plasma lipid levels and insulin levels of high-fat diet fed mice (n=8)

? *表示與正常組比較，P<0.05；#表示與高脂組比較，P<0.05。

2.4 對高脂膳食小鼠肝臟氧化還原狀態的影響

目前有報道[22]指出，糖尿病肝損傷的發生率在10%～30%。糖尿病與肝臟相關代謝異常主要表現為糖、脂代謝紊亂。MDA作為脂質過氧化的終末產物，直接反應氧化應激水平[23]?？寡趸甘菣C體抗氧化系統中的重要組成部分，包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)等。SOD可通過清除ROS、分解過氧化產物等保護機體抵御氧化應激。

由表6可知，殼聚糖的添加能夠增加高脂膳食小鼠CAT活性，但差異不顯著(P>0.05)。高脂組肝臟MDA含量顯著增加(P<0.05)，殼聚糖添加后能夠顯著降低肝臟MDA含量(P<0.05)。由表6還可知，和正常組相較而言，高脂組小鼠的肝臟的SOD和T-AOC活性有顯著降低(P<0.05)。添加殼聚糖以后，其SOD和T-AOC活性較高脂組顯著升高(P<0.05)，說明殼聚糖能夠顯著增加肝臟抗氧化能力，減少肝臟脂質過氧化，并且高分子量殼聚糖的作用效果好于低分子量殼聚糖組。以上結果表明殼聚糖可明顯改善氧化應激水平，可能為其改善糖尿病肝損傷的機制之一。

表6 不同分子量殼聚糖對高脂膳食小鼠肝臟氧化還原狀態的影響?Table 6 Effects of chitosan with different molecular weight on the liver antioxidant index of high-fat diet fed mice (n=8)

? *表示與正常組比較，P<0.05；#表示與高脂組比較，P<0.05。

2.5 小鼠肝臟基因檢測結果

PEPCK能夠促進草酰乙酸生成磷酸丙酮酸，是糖異生途徑的限速步驟。G6Pase能夠催化葡萄糖-6-磷酸生成葡萄糖，是糖異生途徑的最后步驟[24-25]。G6Pase在糖尿病的病因學和生理學中均有重要的作用，已經成為糖尿病治療的一個潛在靶點[26]。

分別用Real-Time PCR 方法對小鼠肝臟中糖異生關鍵酶PEPCK及G6Pase的基因表達進行檢測(見圖1)，檢測結果顯示，與正常組相比，高脂組小鼠肝臟PEPCK 和 G6Pase 基因水平均顯著增高(P<0.05)，說明高脂組小鼠肝糖異生作用異常，肝臟葡萄糖輸出明顯增多，導致空腹血糖升高。與高脂組小鼠相比，添加殼聚糖組的小鼠PEPCK與G6Pase基因表達有顯著下調(P<0.05)。殼聚糖可有效降低肝臟PEPCK和G6Pase的基因表達水平，與之前研究結果相同[27-28]，抑制肝臟組織糖異生，降低空腹血糖。高分子量殼聚糖對PEPCK基因表達的調節作用優于低分子量殼聚糖。

3 結論

本試驗通過對高脂膳食C57BL/6J小鼠研究、比較不同分子量殼聚糖的降血糖作用。結果表明高脂膳食對小鼠的體重、血脂、血糖以及糖代謝相關基因都有顯著的影響。殼聚糖可以緩解高脂膳食帶來的機體損傷，降低體重增加速度、血脂、血糖，下調糖代謝相關基因的表達。本研究為輔助降血糖功能性食品的研究提供了依據，為開發健康、安全、無毒副作用的輔助降血糖功能食品開辟了道路，然而其調節血糖的作用機理還有待進一步研究。

圖1 C57BL/6J小鼠肝臟組織PEPCK、 G6Pase mRNA 檢測結果Figure 1 The mRNA expression of PEPCK and G6Pase in liver of C57BL/6J mice

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The glucose regulation effect of different molecular weight chitosan on mice fed high-fat diet

(1.SchoolofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China;2.StateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology,Wuxi,Jiangsu214122,China;3.JiangsuHiLongInternationalTradingCo.,Ltd,Huai’an,Jiangsu223005,China)

In order to compare the glucose regulation effect of different molecular weight chitosan on mice fed high-fat diet, 48 male C57BL/6J mice were randomly assigned to four groups, The control group (Control), which consumed a normal diet, The HF group (HF), which was fed with a high-fat diet, The HF+LWMC and HF+HWMC groups, which were fed with a high-fat diet supplement with 5% low weight molecular chitosan and 5% high weight molecular chitosan, respectively. The diet intake and weight data were collected weekly. The biochemical indicators of serum and liver and the gene expression of PEPCK and G6Pase were determined at the end of the 16 week. The results indicated that supplementation of chitosan could reduce body weights, decrease the levels of serum lipid, and alleviate the liver lipid peroxidation of HF mice. Also, high weight molecular chitosan showed better hypolipidemic effect than low weight molecular chitosan.

chitosan; high-fat diet; hypoglycemic action

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.04.024