木薯蠶蛹的急性毒性與遺傳毒性

李 玲 龍 悅 丁曉雯 - 黃先智 -

(1. 西南大學生物技術學院，重慶 400715；2. 西南大學食品科學學院，重慶 400715；3. 西南大學蠶學與生物系統研究所，重慶 400715)

木薯蠶蛹的急性毒性與遺傳毒性

李 玲1LILing1龍 悅2LONGYue2丁曉雯2DINGXiao-wen2黃先智3HUANGXian-zhi3

(1. 西南大學生物技術學院，重慶 400715；2. 西南大學食品科學學院，重慶 400715；3. 西南大學蠶學與生物系統研究所，重慶 400715)

對木薯蠶蛹的急性毒性和遺傳毒性進行研究。采用急性毒性試驗和遺傳毒性試驗，其中遺傳毒性試驗包括蠶豆根尖微核試驗、小鼠骨髓微核試驗和小鼠精子畸形試驗。結果表明：在急性毒性試驗中，木薯蠶蛹的最大耐受劑量>16 g/kgbw，屬無毒物質；遺傳試驗表明，與陰性對照相比，濃度在250 mg/mL以上的木薯蠶蛹溶液可以極顯著增加蠶豆根尖微核率(P<0.01)；木薯蠶蛹溶液的劑量為5 g/kgbw和2.5 g/kgbw時，可以分別顯著性增加雄性和雌性小鼠的骨髓微核率(P<0.05)；劑量為5 g/kgbw時，可以極顯著增加雄性小鼠的精子畸變率(P<0.01)。木薯蠶蛹在試驗條件下未觀察到急性毒性，在高劑量時有遺傳毒性。

木薯蠶蛹；急性毒性；遺傳毒性

蓖麻蠶(PhilosamiaCynthiariciniBoisduval)是一種無滯育期的多化性完全變態昆蟲，是吐絲結繭的經濟昆蟲之一。蓖麻蠶，屬鱗翅目大蠶蛾科，因主要以蓖麻葉為食，故稱蓖麻蠶，但蓖麻蠶是一種多食性蠶，以木薯葉為飼料時，也稱木薯蠶。木薯蠶蛹是木薯蠶繭抽絲的副產物，具有較高的營養價值。有研究[1-4]證明，木薯蠶蛹含蛋白質64.63%、脂肪22.73%、糖類7.37%、17種氨基酸，人體必需的9種氨基酸占氨基酸總量的45.92%，符合理想蛋白模式。而且，木薯蠶蛹還含維生素A、維生素B1、維生素B2等多種維生素以及豐富的不飽和脂肪酸，其中α-亞麻酸的含量高達39.07%[5-6]，具有促進脂肪代謝、保護肝臟、促進肝細胞再生、降血糖和抗癌等多種功效[7]。

在廣西等產地，隨著木薯產業的發展，食用木薯蠶蛹的人越來越多。但是木薯蠶蛹的成分分析表明，木薯蠶蛹中含砷(1.99±0.84) mg/kg，超出中國GB 2762—2012規定值近3倍，此外還含氰化物(0.33±0.07) mg/kg、鉛(0.14±0.03) mg/kg、鎘(0.54±0.14) μg/kg干樣[8-10]。這些物質導致食用木薯蠶蛹具有相當大的安全隱患，限制了其利用，造成了極大的資源浪費。目前對木薯蠶蛹的安全性評價還未見報道，為了解木薯蠶蛹的食用安全性，更好地利用這一寶貴資源，本試驗根據中國食品安全性評價程序的要求[11]對木薯蠶蛹進行安全性評價。通過小鼠急性毒性試驗和對蠶豆根尖微核細胞、小鼠骨髓細胞以及小鼠精子細胞的遺傳毒性試驗[12]，對其進行毒理學安全性評價，旨在研究木薯蠶蛹的食用安全性，為其進一步開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木薯蠶蛹干：西南大學家蠶基因組生物學重點實驗室提供，產地為廣西南寧。使用前將其研磨制成木薯蠶蛹干粉備用；

蠶豆：購于重慶市北碚區天生市場；

昆明種清潔級小白鼠：許可證號SCXK(渝)2007-0006，重慶市中藥研究院動物研究所；

小牛血清：北京燕生政博生物科技有限責任公司；

Giemsa染液：上海馨晟試化工科技有限公司；

環磷酰胺：山西普德藥業有限公司；

偏重亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉：分析純，溫州市東升化工試劑廠；

甘油：分析純，成都化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

顯微鏡：XSN-3G型，重慶光電儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 急性毒性試驗 按照GB 15193.3—2003急性毒性試驗中最大耐受劑量法進行。選用18～22 g的健康昆明種小鼠，雌雄各半，試驗前禁食不禁水16 h。將木薯蠶蛹干粉用水制備成勻漿，采用0.4 mL/20 g的最大灌胃體積分兩次灌胃，間隔時間為4 h。試驗的總灌胃劑量為16 g/kgbw，灌胃后使其自由進食飲水，連續觀察14 d，記錄小鼠有無中毒表現及死亡情況。

1.3.2 遺傳毒性試驗 遺傳毒性是指有機體受到某些外源性因素影響，發生的遺傳物質損傷造成的毒性作用，包括染色體水平、分子水平和堿基水平的損傷。遺傳毒性試驗一般包括體外和體內兩個級別[13]，用來判定受試樣品是否具有致突變作用。本階段試驗分為蠶豆根尖微核、小鼠骨髓微核、小鼠精子畸形3個試驗，以測試木薯蠶蛹對植物細胞、動物體細胞、動物生殖細胞是否具有致突變作用。

(1) 蠶豆根尖微核試驗：參考文獻[14～16]。稱取木薯蠶蛹粉0.25，1.25，2.5，6.25，12.5 g，研磨，加水定容至25 mL，超聲30 min (常溫，160 W)，過濾，濾液備用。

用蒸餾水在25 ℃恒溫水浴鍋中泡發蠶豆種子，每8 h換水1次，待初生根長至2～3 cm時，選擇粗細、長短一致且發育良好的種子供試驗用。分別用制備好的濾液、陽性對照(10.0 μg/mL環磷酰胺溶液)和陰性對照(蒸餾水)浸泡蠶豆根尖6 h，每組取發芽的種子6～8粒，切下根尖頂端長約1 cm 的幼根經過處理后在顯微鏡下觀察。每個處理組觀察5個以上根尖，每個根尖至少觀察1 000個間期細胞，統計細胞微核數，按式(1)、(2)計算微核率和微核指數：

(1)

(2)

式中：

P——蠶豆根尖微核率，%；

n1——含微核的細胞總數，個；

n2——觀察的細胞總數，個；

V——微核指數；

P1——樣本的微核率，%；

P2——陰性對照的微核率，%。

結果判定：將樣品與陰性對照的微核率進行比較，若差異顯著，而且微核指數大于1.5，即認定試驗樣品具有一定的致突變性。

(2) 小鼠骨髓微核試驗：按照GB15193.5—2003 骨髓細胞微核試驗進行。分別稱取木薯蠶蛹粉0.625，1.250，2.500，5.000g，研磨，并加水定容至10mL。現用現制備。選用健康昆明種小鼠，體重25～30g，隨機分成6組，雌雄各半，每組10只。木薯蠶蛹設4個劑量組(1.25，2.50，5.00，10.00g/kgbw)。另用蒸餾水設陰性對照組，用環磷酰胺設陽性對照組(40mg/kgbw)。給藥方式均為直接經口灌胃，灌胃體積根據小鼠最大灌胃體積0.4mL/20g進行，灌胃2次，間隔24h。第2次灌胃后6h處死小鼠，取胸骨，按規定的方式擠出骨髓液，常規處理后計數。每張片計數1 000個嗜多染紅細胞并計數含微核的嗜多染紅細胞數。微核率按式(3)計算：

(3)

式中：

P——嗜多染紅細胞微核率，%；

n1——含微核的嗜多染紅細胞數，個；

n2——嗜多染紅細胞總數，個。

結果判定：將樣品與陰性對照的微核率進行比較，若有顯著差異則認為試樣具有一定的致突變性。

(3) 小鼠精子畸形試驗：按照GB15193.7—2003小鼠精子畸形試驗[17]進行。分別稱取木薯蠶蛹粉1.25，2.50，5.00g，研磨，并加水定容至10mL。現用現制備。選用健康昆明種的成年雄性小鼠，體重25～35g，隨機分成5組，每組5只。木薯蠶蛹設3個劑量組(2.5，5.0，10.0g/kgbw)，另用蒸餾水設陰性對照組，用環磷酰胺溶液設陽性對照組(40mg/kgbw)。給藥方式均為直接經口灌胃，每次灌胃體積根據小鼠最大灌胃體積0.4mL/20g進行。每天灌胃1次，灌胃5次后自由攝食飲水飼養30d。35d時將小鼠脫頸處死，取兩側附睪制成精子懸液，常規處理后鏡檢。每張片觀察1 000個頭、尾完整的精子，按式(4)計算精子畸形率。

(4)

式中：

P——精子畸形率，%；

n1——畸形精子總數，個；

n2——觀察的精子總數，個。

結果判定：將樣品與陰性對照的精子畸形率進行比較，若有顯著性差異即認為試樣可能具有一定的致突變性。

1.4 數據分析

所得試驗數據用Excel2013版處理,并用SPSS19.0進行差異顯著性檢驗(t檢驗)分析，顯著水平為0.05，極顯著水平為0.01。

2 結果與分析

2.1 木薯蠶蛹對小鼠的急性毒性

急性毒性(acutetoxicity)是指生物機體一次(或24h內多次)接觸某種外源性物質后引起中毒的反應，嚴重時可引起機體死亡。急性毒性試驗是研究受試毒性的第一步[18]。通過急性毒性試驗可以確定試驗動物對受試物的毒性反應、中毒劑量或致死劑量。由于目前廣西地區人們食用木薯蠶蛹而未出現中毒現象，因此在對木薯蠶蛹進行急性毒性評價時，采用最大耐受劑量法(testofmaximumtolerateddose，MTD)，即用最大使用濃度和最大灌胃容量給予受試動物后，連續觀察7～14d，未見任何動物死亡，則MTD大于此劑量(g/kgbw)[19]。

試驗鼠經過兩次劑量為16g/kgbw的灌胃處理后，在14d的觀察期內未見死亡，且無異常表現。解剖結果顯示：與空白對照相比，給予木薯蠶蛹的小鼠內臟無任何異常。根據急性毒性劑量分級表[10]可知，木薯蠶蛹干粉最大耐受劑量>16g/kgbw，屬無毒級別。

本試驗中未觀察到小鼠的急性毒性，分析可能的原因：在急性毒性試驗中，小鼠的氰化物和砷的攝取量分別為(5.28±1.12)，(31.84±13.44)μg/kgbw，遠低于致死量，且急性毒性試驗只進行了兩次灌胃處理，不足以導致小鼠死亡。

2.2 木薯蠶蛹的遺傳毒性

盡管通過急性毒性試驗證明木薯蠶蛹屬無毒，但急性毒性試驗的結果有其局限性，不能反映出試樣潛在的危害，需要進一步進行遺傳毒性試驗。

2.2.1 蠶豆根尖微核試驗 蠶豆根尖微核(micronucleus，MCN)是蠶豆根尖細胞在分裂時受到外界誘變因子的作用，所產生不能愈合的片段染色體[12]。外界誘變因子越強，微核產生越多，因此微核率可以用來評價誘變因子對生物遺傳物質的影響程度。蠶豆根尖微核試驗不僅快速、簡便、重復性好、靈敏度高，且檢測結果與動物試驗結果具有很高的一致性[18]。1986年國家環保局已將蠶豆根尖微核試驗列入《環境檢測技術規范》用于水環境檢測[19]。隨著研究與應用的深入，目前該試驗已作為一種方便快捷的體外測試方法，大范圍應用于食品致突變性的檢測中[20-23]。

由表1可知，在試驗設定的濃度范圍內，木薯蠶蛹溶液濃度為250，500mg/mL時的蠶豆根尖微核指數分別為1.45和1.89，與陰性對照相比極顯著增加(P<0.01)，且500mg/mL組的微核指數大于1.5，而其他較低濃度的試樣均未呈現顯著性差異(P>0.05)。因此，500mg/mL以上濃度的木薯蠶蛹粉對蠶豆根尖細胞具有致突變作用。

2.2.2 小鼠骨髓微核試驗 小鼠骨髓微核試驗(Bonemarrowcellmicronucleustest)是通過測定小鼠骨髓中的嗜多染紅細胞(polychromatic erythrocytes，PCE)的微核發生率，對細胞的遺傳損傷進行檢測的一種常用的體內微核試驗方法[24]。骨髓嗜多染紅細胞微核的形成是在成熟紅細胞發展為紅細胞的過程中受到某些誘變因子作用導致主核排出，將微核留在紅細胞胞漿內形成的。

表1 蠶豆根尖微核試驗?Table 1 Micronucleus test in vicia faba root tip cells

? *表示P<0.05，即樣本與陰性對照存在顯著性差異； **為P<0.01，即樣本與陰性對照存在極顯著性差異。

由表2可知，在雄性小鼠和雌性小鼠中，陽性對照組較陰性對照組都存在極顯著性差異(P<0.01)，說明在此條件下試驗結果是可靠的。

雄性小鼠組中，低劑量1.25，2.5 g/kg·bw的木薯蠶蛹粉組，其小鼠骨髓嗜多染紅細胞的微核率分別為(3.00±0.762)‰和(2.60±1.12)‰，與陰性對照不存在顯著性關系(P>0.05)；而在5 g/kg·bw劑量處理下，雄性小鼠的骨髓微核率為(3.60±1.35)‰，與陰性對照組存在顯著性差異(P<0.05)；在10 g/kg·bw劑量，小鼠的骨髓微核率為(5.33±1.40)‰，與陰性對照組存在極顯著性差異(P<0.01)。

雌性小鼠組中，在2.5，5 g/kg·bw劑量組，小鼠骨髓嗜多染紅細胞的微核率分別為(2.80±1.08)‰和(2.80±0.77)‰，均與陰性對照組存在顯著性差異(P<0.05)；10 g/kg·bw劑量組的小鼠骨髓微核率為(4.40±1.45)‰，與陰性對照組存在極顯著性差異(P<0.01)。

表2 小鼠骨髓微核率試驗?Table 2 Mouse bone marrow micronucleus

? *表示P<0.05，即樣本與陰性對照存在顯著性差異； **為P<0.01，即樣本與陰性對照存在極顯著性差異。

根據以上試驗結果，木薯蠶蛹粉在5，10 g/kg·bw劑量時，對雄小鼠的體細胞具有致突變作用，在2.5，5.0，10.0 g/kg·bw劑量時對雌小鼠的體細胞具有致突變作用。

2.2.3 小鼠精子畸形試驗 精子畸形的發生是其基因發生突變的結果，故可通過精子形態改變提示基因發生改變。小鼠精子畸形試驗(Mice sperm abnormality test)是通過觀察精子形態的變化來判斷受試物對實驗動物精子形成與發育的影響，進而檢測受試物對雄性生殖細胞的影響[17]。

由表3可知，陽性對照組較陰性對照組差異極顯著(P<0.01)，說明在此條件下試驗結果是可靠的。

5，10 g/kg·bw劑量的木薯蠶蛹組，其精子畸形率與陰性對照組均存在極顯著性差異(P<0.01)，表明5 g/kg·bw以上劑量的木薯蠶蛹溶液可能對小鼠生殖細胞有致突變作用。

表3 木薯蠶蛹對小鼠精子畸變發生率的影響?Table 3 Effects of cassava silkworm pupa on mouse sperm shape abnormality rates

? *表示P<0.05，即樣本與陰性對照存在顯著性差異； **為P<0.01，即樣本與陰性對照存在極顯著性差異。

由圖1可知，木薯蠶蛹對小鼠精子畸變的發生類型主要為尾部折疊，其次是不規則頭、無鉤、小頭及香蕉形，雙尾、雙頭、尾部卷曲發生率較低。

遺傳毒性試驗表明，一定劑量下的木薯蠶蛹對蠶豆根尖細胞、小鼠骨髓細胞和雄性小鼠生殖細胞均存在致突變作用。分析該突變作用可能與木薯蠶蛹中含有的有毒有害成分相關。木薯蠶蛹中含砷(1.99±0.84) mg/kg[8]，超過國家標準規定近3倍[25]。砷的化合物具有致癌、致畸、致突變等性質[26-28]，人的三氧化二砷經口致死量為0.76～1.95 mg/kg。而且，木薯蠶蛹干樣含氰化物(0.33±0.07) mg/kg[8]。氰化物也是劇毒物質之一，口服氫氰酸致死量為0.7～3.5 mg/kg·bw，口服氰化鈉、氰化鉀致死量為1～2 mg/kg·bw。氰化物可以阻斷細胞呼吸鏈造成內窒息，嚴重時可導致中樞性呼吸衰竭而死亡。此外，木薯蠶蛹中還含有鉛、鉻等重金屬[8]，雖然含量沒有超標，但是不能排除其影響，需要進一步的研究。

圖1 小鼠精子畸形類型Figure 1 The types of mouse sperm deformity

此外，木薯蠶以木薯葉為食料，木薯蠶蛹的遺傳毒性還可能與木薯葉有關。對木薯葉的分析表明，木薯葉中含有生氰糖苷、氫氰酸等有害成分，生氰糖苷可以水解產生氫氰酸，氫氰酸作為氰化物可以引起中毒反應[29]。楊娟等[30]發現，木薯葉在超過7.5 mg/mL濃度時，對蠶豆根尖細胞、小鼠骨髓細胞和雄性小鼠生殖細胞均存在致突變作用，這與木薯蠶蛹的試驗結果相似。推測木薯蠶食用木薯葉后，木薯葉中的有毒物質在蠶體內有一程度的積累作用，并最終導致木薯蠶蛹具有遺傳毒性，但還需進一步的試驗證明。

3 結論

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The acute toxicity and genotoxicity of Cassava Silkworm Pupa

(1.CollegeofBiotechnology,SouthwestUniversity,Chongqing400716,China;2.CollegeofFoodScience,SouthwestUniversity,Chongqing400716,China;3.StateKeyLaboratoryofSilk-wormGenomicBiology,Chongqing400716,China)

Objective：To study the acute toxicity and genotoxicity of silkworm pupa. Methods: The study was carried out by acute toxicity test and genotoxicity test. The genetic toxicity test was divided into micronucleus test inViciafabaroot tip cells, mouse bone marrow micronucleus test and mouse sperm abnormality test. Results: The maximum tolerated dose of the mouse to the silkworm chrysalis was greater than 16 g/kgbw in acute toxicity test, which meant that this substance was non-toxic. In genetic test, compared with negative control, when the concentration of cassava silkworm chrysalis was above 250 mg/mL, the broad bean root tip micronucleus rate increased significantly (P<0.01); when the dose is 5 g/kgbw and 2.5 g/kgbw, cassava silkworm chrysalis could significantly increase the male and female mice bone marrow micronucleus rate respectively (P<0.05); in 5 g/kgbw, cassava silkworm chrysalis could significantly increase the odds of male mice sperm aberration (P<0.01). Conclusion: Under experimental condition, the acute toxicity of cassava silkworm pupa was not observed, but the genetic toxicity could be observed in high doses.

cassava silkworm pupa; acute toxicity; genetic toxicity

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.04.010