紫米營養功能成分及其游離態與結合態組成的HPLC/LC-MS分析

楊 寧 熊思慧 - 何靜仁 - 蔡 杰 李書藝 - 何 毅 金偉平 - 祝振洲 -

(武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430070)

紫米營養功能成分及其游離態與結合態組成的HPLC/LC-MS分析

楊 寧YANGNing熊思慧XIONGSi-hui何靜仁HEJing-ren蔡 杰CAIJie李書藝LIShu-yi何 毅HEYi金偉平JINWEI-ping祝振洲ZHUZhen-zhou

(武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430070)

以墨江紫米為研究對象，采用CIE Lab、HPLC和LC-MS等分析技術并結合GB/T 5009.3—2010、5009.4—2010和5009.9—2008標準檢測方法，全面地分析了紫米中基本營養成分和功能活性物質，并研究其呈色特征，同時對紫米多酚酸、黃酮和花色苷類物質的游離態與結合態組成進行鑒定和定量分析。結果表明：在基本營養成分方面，紫米與普通白米相比含量差異較大。紫米的蛋白質含量較白米高23%、灰分含量較白米高31%，而淀粉含量低于白米約15%。測色儀的色澤表征表明紫米和白米在色度、透明度等外觀品質方面有極大的色差。紫米總花色苷和游離態與結合態總多酚、總黃酮的含量均高于白米，且以游離態的多酚和黃酮為主。HPLC、LC-MS分析結果表明，紫米酚酸黃酮類物質主要包括原兒茶酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、表兒茶素、p-香豆素、蘆丁和阿魏酸等；花色苷主要為矢車菊素-3-葡萄糖苷、錦葵-3-葡萄糖苷和芍藥-3-葡萄糖苷。研究結果可為墨江紫米品質評價與鑒定，以及后續營養功能性紫米食品的開發提供方法學參考和科學依據。

紫米；營養功能成分；多酚；黃酮；花色苷

稻谷在中國傳統膳食中占有重要地位。隨著人民生活水平提高，高營養、高附加值稻米品種愈受消費者青睞，有色稻米的潛在價值也備受重視。有色稻米不僅作為食材，也可作為新型營養功能性食品的一種重要原材料。紫米是一種天然“功能型”“營養型”“效益型”的珍稀谷類[1-2]，是中國消費量最大的功能型稻米。明代李時珍《本草綱目》中早已記載食用，紫米具有“滋陰補腎、健脾暖肝、明目活血”等功效，其外觀呈紫黑色，粒大而飽滿，俗稱“紫珍珠”[3]。

紫米中含有豐富的蛋白質以及花色苷、黃酮和酚酸類等生物活性物質，是一種功能型植物蛋白資源食品[4]。目前有關紫米的營養和功能性成分研究主要集中在其花青素類組成[5-6]及其生物活性方面[7-9]，現已發現的黑米花色苷類物質以矢車菊素-3-葡萄糖苷和芍藥素-3-葡萄糖苷為主，其他類含量相對較少[10]。然而，對其基本營養成分與功能成分的全面分析，尤其是對游離態和結合態多酚、黃酮類物質和花色苷組分全面分析研究鮮有報道[11-13]。Shen等[12]和葉玲旭等[13]發現黑色和紅色糙米中游離酚含量和抗氧化能力高于普通糙米，且游離酚含量與米粒顏色相關，但其研究對象主要為稻米、糙米，且未對紫米主要營養成分進行測定，對其花色苷類物質也未進行組成和結構表征分析。本研究擬全面分析紫米中主要營養功能性成分及其組成，并采用高效液相色譜及色譜-串聯質譜方法進一步分析游離態與結合態的酚酸、黃酮類物質及花色苷的組成，同時比較紫米與普通白米間呈色特征及營養功能性組分差異，為墨江紫米的品質評價及相關食品的深度開發利用提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

墨江紫米：墨紫1號，云南回歸優質農特產品經貿有限公司；

普通白米：武漢常青農產品市場；

沒食子酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、原兒茶酸標準品：純度>98%，阿拉丁公司；

表兒茶素、蘆丁、阿魏酸、白藜蘆丁、p-香豆素：純度>98%，美國Sigma公司；

乙腈、冰醋酸、甲酸、甲醇等：色譜純，美國Fisher公司；

乙酸乙酯、正己烷：分析純，國藥集團化學有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

高速萬能粉碎機：FW80 微型，鄭州科豐儀器有限公司；

臺式分光測色儀：UItraScan VIS型，美國HunterLab公司；

超聲波清洗機：SB-2500 DTN型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

旋轉蒸發儀：R-3型，瑞士Buchi公司；

液相色譜-質譜聯用儀：LTQ XL型，美國賽默飛世爾科技有限公司；

凱氏定氮儀：UDK 159型，北京盈盛恒泰科技有限責任公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理方法 將紫米樣品粉碎，過40目篩，得到紫米米粉，置于干燥器中備用(-20 ℃冰箱備用)。

1.2.2 總花色苷的提取 準確稱量紫米粉5 g，用50 mL 70%的乙醇(pH=2)溶液50 ℃水浴浸提，重復提取2次，合并有機相，過G2砂芯漏斗，真空旋轉蒸發后定容。

1.2.3 游離態酚酸的提取 根據文獻[14]修改如下：取10 g紫米粉加入100 mL正己烷置于錐形瓶中超聲脫脂3次，每次20 min，脫脂后紫米粉在通風櫥放置12 h以除掉殘余正已烷，取3 g脫脂紫米粉加入30 mL 80%甲醇溶液30 ℃超聲提取3次，每次1 h，合并上清液，減壓濃縮至20 mL，濃縮液用等體積的乙酸乙酯振蕩萃取5次，合并有機相，減壓干燥后用80%甲醇定容至10 mL，置于-20 ℃冰箱待測。

1.2.4 結合態酚酸的提取 根據文獻[15]修改如下：收集1.2.3中由80%甲醇溶液提取后所余沉淀部分，用40 mL 2 mol/L NaOH溶液在室溫下充氮攪拌4 h，用6 mol/L HCl酸化至pH=2，用乙酸乙酯重復萃取5次，合并有機相，減壓蒸發至干，用80%甲醇定容至10 mL，置于-20 ℃冰箱待測。

1.2.5 一般指標測定

(1) 水分含量：按GB/T 5009.3—2010執行。

(2) 灰分含量：按GB/T 5009.4—2010執行。

(3) 總淀粉含量：按GB/T 5009.9—2008的酶水解法執行。

1.2.6 總蛋白含量的測定 精密稱量0.2 g樣品放入消化管，加入0.2 g硫酸銅，6 g硫酸鉀及15 mL濃硫酸，在40 ℃ 10 min、270 ℃ 1.5 h、480 ℃ 2 h 條件下于VELP自動消化爐中消化。待消化管冷卻置至室溫，裝入VELP全自動凱式定氮儀，使用33% NaOH溶液、4%硼酸溶液蒸餾及接受氮氣，用0.1 mol/L 標定的HCl溶液滴定，試驗中蛋白質的轉換系數為6.25，試驗結果由儀器自動計算。

1.2.7 顏色的表征 根據文獻[16]修改如下：普通大米、紫米磨粉，過100目篩，充分混均，用色差儀測定紫米的L*、a*、b*等值并分析數據，L*代表亮度， +a*和-a*分別表示紅色、綠色，+b*和-b*分別表示黃色、藍色。

1.2.8 紫米總花色苷含量的測定 根據文獻[17]修改如下：采用pH示差法測量紫米花色苷的含量，首先取紫米花色苷提取液在波長為400～700 nm范圍內進行紫外全掃描，確定紫米花色苷提取液的最大吸收波長為λmax。然后將1 mL的紫米濃縮液分別用pH 1.0緩沖液(0.2 mol/L HCl∶0.2 mol/L KCl∶H2O，體積比25∶67∶8)和pH 4.5的緩沖液稀(CH3COOH∶CH3COONa∶H2O，體積比0.98∶1.80∶97.22)定容到10 mL，室溫下平衡20 min，分別測定兩種樣品稀釋液在λmax和700 nm處的吸光值?？偦ㄉ蘸堪词?1)計算：

(1)

式中：

C——總花色苷含量，mg Cy-3-glc/g；

A——吸光度；

V——提取液總體積，mL ；

n——稀釋倍數；

M——矢車菊-3-葡萄糖苷(Cy-3-glc)的相對分子質量，449.4；

ε——Cy-3-glc消光系數，26 900；

m——樣品質量，g。

1.2.9 HPLC-MS分析 將花色苷提取液用等體積的乙酸乙酯振蕩萃取3次，合并水相層，過AB-8大孔吸附樹脂純化處理，用70%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液減壓濃縮并定容至5 mL，過0.22 μm微孔濾膜，待HPLC-MS測定。

流動相條件見表1。色譜柱：Thermo Fisher反相C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)，柱溫 25 ℃，檢測器使用DAD，進樣體積10 μL，流速150 μL/min，檢測波長520 nm。

MS參數：采用ESI正離子掃描模式，毛細管溫度350 ℃；毛細管電壓26 V；N2流速20 L/min。

表1 梯度洗脫方法?Table 1 Gradient elution programme

? 流動相A為0.3%甲酸水溶液，流動相B為體積比0.3∶30∶69.7的甲酸—乙腈—水溶液。

1.2.10 黃酮含量測定 以蘆丁做對照，采用Al(NO3)3-NaNO2-NaOH比色法分別對紫米中游離態和結合態酚類物質提取物進行總黃酮含量測定，以濃度C(μg/mL)為橫坐標，吸光度A為縱坐標繪制標準曲線[18]。

1.2.11 總酚含量的測定 以沒食子酸作對照，采用Folinlin-Ciocalteu法分別對紫米中游離態和結合態酚類物質提取物進行總酚含量測定，以濃度C(μg/mL)為橫坐標，吸光度A為縱坐標繪制標準曲線[19]。

1.2.12 酚類物質HPLC分析 標準曲線建立：用80%甲醇溶液配置10種多酚類物質標準品混合溶液(沒食子酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、原兒茶酸、表兒茶素、蘆丁、阿魏酸、白藜蘆丁、p-香豆素)，分別考察其峰面積和濃度之間的線性回歸關系，建立標準曲線。

HPLC條件：Alltima C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。柱溫：30 ℃。檢測波長：280 nm與320nm。流速：0.8 mL/min。流動相：A為水∶乙酸(體積比99.5∶0.5)，B為乙腈∶水(體積比50∶50)，見表2。

表2 梯度洗脫方法Table 2 Gradient elution programme

2 結果與分析

2.1 基本營養成分分析

由表3可知：紫米與普通白米水分含量基本一致；紫米中蛋白質含量較白米高23%、灰分含量較白米高31%，而總淀粉含量低于白米約15%，因此，在基本營養成分方面，紫米與普通白米含量差異較大。

表3 紫米和白米的基本成分含量Table 3 The basic composition of purple rice %

2.2 顏色表征

由表4可知：白米的透明度L*遠高于紫米；紫米紅色值a*>白米a*；紫米的黃色值b*>白米b*；c*值越高表明顏色越鮮艷，紫米粉c*<白米c*，表示紫米的顏色較白米黯淡；紫米色調h與白米h有明顯的差異；△E*為色澤的總體變化差值，紫米△E*大于白米△E*，表明紫米和白米有較大的色澤差。

紫米和白米顏色表征結果能有效反映兩類稻米的物理特性——顏色差異，可為稻米外觀品質差異化評價提供有效的參考依據。

2.3 主要功能性成分及其組成鑒定的分析

2.3.1 總花色苷、總酚和總黃酮含量分析 由表5可知：紫米中花色苷、總酚和總黃酮含量均高于白米。白米中基本不含花色苷，紫米中總花色苷的含量為2.51 mg Cy-3-glc /g；紫米中游離態多酚含量高于結合態3倍，游離態黃酮含量高于結合態9倍，結果與Shen等[12-13]對有色稻米中游離態多酚和黃酮研究結果相近；與李青等[20]對稻谷殼中游離和結合態多酚、黃酮類物質研究比較，谷殼中結合態酚類和黃酮類比例較高，可能與稻谷品種以及多酚、黃酮分布有關。紫米游離態多酚和黃酮含量分別為5.44 mg GAE/g和2.93 mg RE/g，顯著高于白米游離態多酚和黃酮含量0.37 mg GAE/g和0.18 mg RE/g；紫米結合態多酚和黃酮含量1.98 mg GAE/g和0.33 mg RE/g，也明顯高于白米結合態多酚和黃酮含量0.31 mg GAE/g和0.20 mg RE/g。紫米中功能性物質具有較強的氧自由基清除能力、抗氧化活性和降血脂功效[21-22]，試驗所測墨江紫米中3種主要功能性物質含量不僅高于普通白米，其總酚含量也遠高于其他三大主糧作物(小麥、玉米、馬鈴薯)[23-26]，且與其他有色農產品相比，紫米總花色苷含量也相對較高[27]。

?L*為透明度；a*為紅色值，b*為黃色值，c*為顏色純度，h為色調值，△L*為明度差異，△E*為色差值。

表5 紫米主要功能性物質的含量Table 5 Concentration of functional active substances from purple rice

2.3.2 紫米酚酸黃酮類成分的組成分析 采用1.2.9 HPLC法同時測定樣品中10種酚酸黃酮類物質，混合標準品色譜圖見圖1，10種酚酸黃酮類物質色譜峰分離度較好。

分別對紫米中游離態和結合態酚酸黃酮類物質進行分析，結果表明，紫米中原兒茶酸、香草酸、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、p-香豆素、蘆丁和阿魏酸在游離態和結合態中均有檢出。游離態多酚類物質中含量最高的是原兒茶酸(14.48 mg/100 g)，其次是香草酸(6.59 mg/100 g)和阿魏酸(2.41 mg/100 g)，在結合態酚類物質中含量最高的分別是阿魏酸(30.21 mg/100 g)、香草酸(4.53 mg/100 g)和綠原酸(2.38 mg/100 g)。

1. 沒食子酸 2. 原兒茶酸 3. 綠原酸 4. 香草酸 5. 咖啡酸 6. 表兒茶素 7.p-香豆素 8. 蘆丁 9. 阿魏酸 10. 白藜蘆醇

圖1 10種酚酸黃酮類混合標準品的HPLC

色譜圖(280 nm)Figure 1 HPLC chromatograms of a standard mixture of phenolics andflavonoids(280 nm)

由表6可知，墨江紫米所含酚酸黃酮類物質較為豐富，在所測得8種酚酸黃酮類物質中，咖啡酸、表兒茶素和p-香豆素游離態含量與其結合態含量基本一致，而其他組分游離態和結合態含量具有較大差異，特別是結合態阿魏酸含量較其游離態高15倍。稻谷中酚酸種類繁多，主要由對羥基苯甲酸和對羥基肉桂酸衍生物組成，種類隨著分子結構中苯環上羥基數量和取代位置的不同而變化[20]，試驗結果與葉玲旭等[13]對有色糙米中酚類組分分析結果比較發現，墨江紫米中含有表兒茶素，但沒有測出沒食子酸；其他酚類組成基本一致，但各組分含量略有不同，可能是與稻米品種和生長環境有關。

表6 紫米中酚酸黃酮類物質的含量Table 6 The content of phenolics andflavonoids in purple rice mg/100 g

2.3.3 紫米中花色苷類物質的組成分析 對紫米中花色苷類物質進行HPLC-MS分析，所得色譜圖見圖2，通過對主要3個色譜峰進行一級和二級質譜掃描，結果見圖3～5。

色譜峰1(Rt=6.94 min)，分子離子m/z為449，二級質譜顯示分子離子m/z為449失去一分子葡萄糖 [M-162]+得碎片離子m/z287，質譜信息可知m/z287是矢車菊素，可推斷峰1是矢車菊素-3-葡萄糖苷。

色譜峰2(Rt=10.05 min)，分子離子m/z為463，二級質譜顯示分子離子m/z為463失去一分子葡萄糖 [M-162]+得碎片離子m/z301，質譜信息可知m/z301是芍藥素。因此，峰2是芍藥素-3-葡萄糖苷。

色譜峰3(Rt=11.88 min)，分子離子m/z為493，二級質譜顯示分子離子m/z為493失去一分子葡萄糖 [M-162]+得碎片離子m/z331，質譜信息可知m/z331是錦葵花色素。因此，推斷峰3是錦葵-3-葡萄糖苷。

由圖2可知，試驗所測墨江紫米中3種花色苷成分以矢車菊素-3-葡萄糖苷為主，與張名位等[6]報道結果一致，但未測出天竺葵-3，5-二葡萄糖苷等其他種類花色苷，可能是墨江紫米品種及生長環境差異。

1. 矢車菊素-3-葡萄糖苷 2. 芍藥-3-葡萄糖苷 3. 錦葵-3-葡萄糖苷圖2 紫米花色苷的HPLC圖譜Figure 2 HPLC chromatograms of the anthocyanin extracts from purple rice

3 結論

(1) 紫米與普通白米水分含量基本一致，但灰分、總蛋白質和總淀粉含量差異較大：紫米中蛋白質含量較白米高23%、灰分含量較白米高31%，而總淀粉含量明顯低于白米約15%；測色儀的色澤表征表明紫米和白米在色度、透明度等外觀品質方面有極大的色差。

圖4 峰2的一級、二級質譜圖及芍藥素-3-葡萄糖苷結構式Figure 4 Mass spectrum of peak 2 structure of Peonidin-3-O-glucoside

圖5 峰3的一級、二級質譜圖及錦葵-3-葡萄糖苷結構式Figure 5 Mass spectrum of peak 3 structure of Mallow 3-glucoside

(2) 紫米中花色苷、總酚和總黃酮含量均高于白米：紫米中總花色苷的含量為2.51 mg Cy-3-glc /g，而白米中基本不含花色苷；紫米中多酚和黃酮類物質主要以游離態形式為主，紫米游離態多酚含量為5.44 mg GAE/g，顯著高于白米中游離酚含量0.37 mg GAE/g；紫米游離酚提取物中黃酮含量2.93 mg RE/g，也明顯高于白米中黃酮含量0.33 mg RE/g。

(3) 紫米酚酸及黃酮類物質主要包括原兒茶酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、表兒茶素、p-香豆素、蘆丁和阿魏酸等；花色苷主要由矢車菊素-3-葡萄糖苷、錦葵-3-葡萄糖苷和芍藥-3-葡萄糖苷組成。

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Nutritional and functional components in purple rice and free and bond state compositions analyzed by HPLC/LC-MS

(SchoolofFoodScienceandEngineering,WuhanPolytechnicUniversity,Wuhan,Hubei430023,China)

CIE Lab, HPLC-DAD and LC-MS techniques, combined with the national standards methods were applied to determine the basic nutrient and functional compounds of purple rice, and compared with the white rice. HPLC-DAD was used to quantitative analyze the contents of phenolics and flavonoids, and the main kinds of anthocyanins were identified with LC-MS. As a result, there is a big difference on the content of basic nutritional compound: purple rice protein content is 23% higher than white rice, and ash content is 31% higher, but starch content is 15% lower than white rice. And great differences on color value, luminance and chromatic aberration have also been found by color spectrophotometer. On the other hand, purple rice has higher content of anthocyanin, total phenols and flavonoids than white rice, and mainly existed on free states. Based on HPLC and HPLC-MS method, the phenolic acids and flavonoids were analyzed, mainly including protocatechuic acid, chlorogenic acid, vanillic acid, caffeic acid, epicatechin,p-coumarin, rutin and ferulic acid, and anthocyanins are mainly knapweed-3-glucoside, mallow-3-glucoside and peony-3-glucoside. This study may provide experimental basis for further quality evaluation method and development research on functional active substances in the purple rice.

purple rice; nutritional and functional compositions; phenolics; flavonoids; anthocyanin

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.04.006