椎間盤退變患者髓核組織中HtrA1的表達及其與MMPs的關系

岳佳偉，李大鵬，吳燕，黃永輝

(1江蘇大學附屬醫院，江蘇鎮江 212001；2江蘇大學醫學院)

椎間盤退變患者髓核組織中HtrA1的表達及其與MMPs的關系

岳佳偉1，李大鵬1，吳燕2，黃永輝1

(1江蘇大學附屬醫院，江蘇鎮江 212001；2江蘇大學醫學院)

目的 觀察椎間盤退變患者髓核組織中高溫必需因子A1(HtrA1)的表達及其與基質金屬蛋白酶(MMPs)的關系。方法 78例接受椎間盤髓核切除患者，其中年輕脊柱骨折患者(改良Thompson分級Ⅰ級)10例，椎間盤退變患者68例(改良Thompson分級Ⅱ級22例、Ⅲ級24例、Ⅳ級22例)。采用real-time PCR和Western blotting法分別檢測椎間盤髓核組織中的HtrA1及MMP-1、3、7、9、13 mRNA和蛋白，并采用Pearson法分析HtrA1和MMP-1、3、7、9、13的相關性。結果 改良Thompson分級Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級患者椎間盤髓核組織中HtrA1 mRNA分別為0.56±0.49、0.70±0.45、1.47±0.86、4.10±1.17，蛋白分別為0.16±0.09、0.52±0.07、1.21±0.26、3.10±0.17，兩兩相比P均<0.05。不同改良Thompson分級患者椎間盤髓核組織中MMP-1、3、13的mRNA、蛋白表達兩兩相比P均<0.05。HtrA1 mRNA與MMP-1、3、13 mRNA表達呈正相關(r2分別為0.144 8、0.240 6、0.869 5，P均<0.01)。結論 椎間盤髓核組織中HtrA1的表達隨椎間盤退變程度的升高而升高，且與MMP-1、3、13的表達有關。

椎間盤退變；高溫必需因子A1；基質金屬蛋白酶

椎間盤退行性疾病是臨床上常見病，發病趨于年輕化，是導致頸肩腰腿痛的一個重要原因，椎間盤退變是椎間盤退行性疾病的病理學基礎[1]，多種因素均可促進椎間盤退變的發生[2]，但具體的細胞分子機制尚不清楚。髓核是椎間盤的重要組成部分，由髓核細胞以及細胞外基質組成。髓核中的細胞外基質處于合成代謝與分解代謝的動態平衡，當細胞外基質分解過多時，髓核的水分將會流失，固有的彈性也將喪失，進而導致椎間盤生物力學功能減退[3]。高溫必需因子A1(HtrA1)為絲氨酸蛋白酶家族成員，是一種分泌蛋白，可促進細胞外基質的分解[4]。基質金屬蛋白酶(MMPs)是一組需要Zn2+、Ca2+等金屬離子作為輔助因子的同工酶，其功能為參與細胞外基質的降解，具有減少細胞外和基膜組分的作用。MMPs的上調可導致髓核變性，從而引起相應的椎間盤病變[5]。目前研究較多的參與椎間盤退變過程的MMPs為MMP-1、3、7、9、13。關于HtrA1在椎間盤退變中的作用目前研究較少，因此本研究觀察了不同改良Thompson分級椎間盤髓核組織中HtrA1的表達情況，并探討其與MMP-1、3、7、9、13表達的關系?，F將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年1月～2016年1月在江蘇大學附屬醫院行椎間盤髓核切除者78例，其中年輕脊柱骨折患者(改良Thompson分級Ⅰ級)10例，椎間盤退變患者68例(改良Thompson分級Ⅱ級22例、Ⅲ級24例、Ⅳ級22例)。所有患者術前無腫瘤、感染、炎癥等。手術中切取所有患者椎間盤髓核組織中央部分。本研究經江蘇大學附屬醫院醫學倫理委員會審批，并與患者簽訂知情同意書。

1.2 椎間盤髓核組織中HtrA1及MMP-1、3、7、9、13 mRNA表達檢測 采用real-time PCR。取50～100 mg新鮮髓核組織，剪碎置入裝有1 mL TRIzol試劑(Invitrogen公司)的研磨器中，迅速研碎。移至1.5 mL無菌進口EP管中，反復吹打，應用異硫氰酸胍-酚-氯仿法提取總RNA。采用核酸蛋白質檢測儀檢測RNA的濃度，并按Invitrogen公司逆轉錄試劑盒(18080-051)說明書合成cDNA，逆轉錄反應按照試劑盒說明進行。采用10 μL逆轉錄反應體系，其中包括總RNA 1 μL、MgCl22 μL、10×RT Buffer 1 μL、RNase Free dH2O 3.75 μL、dNTP(各10 mmol/L)1 μL、RNase Inhibitor 0.25 μL、AMV Reverse Transcriptase 0.5 μL、OligodT 0.5 μL。采用Oligo 6軟件設計引物，所有引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。以cDNA為模板，采用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(DRR420A)進行熒光定量PCR反應，反應條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性5 s，于Tm值下退火延伸30 s，擴增40個循環。72℃延伸時采集熒光信號。以β-actin為內參，采用2-ΔCt法分析HtrA1及MMP-1、3、7、9、13 mRNA相對表達量。

1.3 椎間盤髓核組織中HtrA1及MMP-1、3、7、9、13蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取20～40 mg新鮮髓核組織，剪碎，加入1 mL預冷的RIPA(含PMSF)裂解液，超聲勻漿器勻漿后冰浴10 min，將勻漿液收集于EP管中，4 ℃、12 000 r/min離心15 min。取上清，采用Bradford法測定總蛋白濃度，并按比例加入含β-巰基乙醇的Buffer，于沸水煮變性后置-20 ℃保存。凝膠電泳，轉PVDF膜，滴加100 μL一抗[HtrA1兔單克隆抗體NBP2-23869(1∶500，Novusbio公司)、MMP-1兔單克隆抗體BS1229(1∶500，Bioworld Technology公司)、MMP-3兔單克隆抗體ab52915(1∶1 000，abcam公司)、MMP-7鼠單克隆抗體sc-8832(1∶200，Santa Cruz公司)、MMP-9鼠單克隆抗體ab58803(1:500，abcam公司)、MMP-13兔單克隆抗體ab39012(1∶3 000，abcam公司)]，4 ℃孵育過夜。TBST洗3次，滴加相應二抗(1∶5 000)，37 ℃孵育1 h，用TBST洗3次。滴加ECL發光劑顯色，于凝膠成像系統掃描條帶，運用Image J軟件分析掃描結果，計算目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 不同改良Thompson分級患者髓核組織中HtrA1及MMP-1、3、7、9、13的mRNA表達比較 見表1。

表1 不同改良Thompson分級患者髓核組織中HtrA1及MMP-1、3、7、9、13的mRNA表達比較

注：與Ⅰ級相比，▲P<0.05；與Ⅱ級相比，*P<0.05；與Ⅲ級相比，#P<0.05。

2.2 不同改良Thompson分級患者髓核組織中HtrA1及MMP-1、3、7、9、13的蛋白表達比較 見表2。

表2 不同改良Thompson分級患者髓核組織中HtrA1及MMP-1、3、7、9、13的蛋白表達比較

注：與Ⅰ級相比，▲P<0.05；與Ⅱ級相比，*P<0.05；與Ⅲ級相比，#P<0.05。

2.3 HtrA1與MMP-1、3、7、9、13表達的相關性 78例椎間盤髓核切除者髓核組織中HtrA1 mRNA與MMP-1、3、13 mRNA表達呈正相關(r2分別為0.1448、0.2406、0.8695，P均<0.01)。

3 討論

椎間盤退變是一個復雜的過程，其疾病的病理機制歸因于組成細胞外基質的聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的流失[2]。HtrA1是一種具有熱休克蛋白性質的膜絲氨酸蛋白，是第一個被發現的人類的該酶家族成員，最初在肉毒病毒40成纖維細胞中被發現。HtrA1絲氨酸蛋白酶的研究多見于腫瘤方面[6]。也有相關研究[3,7]發現，HtrA1在骨關節炎、類風濕關節炎關節軟骨組織中的表達量增加，在骨關節炎中起重要的調控作用。同時，亦有學者發現，HtrA1啟動子的單核苷酸多態性與椎間盤退變相關[8]。本研究結果發現，隨著改良Thompson分級級數的升高，HtrA1 mRNA、蛋白在椎間盤髓核組織中的表達不斷升高，表明HtrA1可能參與椎間盤退變的過程。

椎間盤的退變始于髓核，MMPs等降解酶的表達增加會導致髓核細胞外基質的降解加快[2]。沈正清等[9]發現，MMP-3可作為腰椎間盤退變的重要調節因子，參與退變進程。正常椎間盤標本沒有肉芽組織形成，凸出型及韌帶下型僅有較少肉芽組織，大多數游離型及經韌帶脫出型有肉芽組織，纖維環和髓核中的肉芽組織形成越多，MMP-1、3的表達就越強[10]。本研究結果發現，隨著改良Thompson分級級數的升高，MMP-1、3的mRNA、蛋白在椎間盤髓核組織中的表達不斷升高。胡峰等[11]發現，椎間盤退變及突出越嚴重,MMP-7表達越強，說明MMP-7與椎間盤的病理改變有關，MMP-7表達增加導致組織降解增強，從而導致椎間盤退變。亦有研究[12]表明，MMP-9在正常髓核內有一定量的表達，在退變腰椎間盤髓核的表達成倍升高，說明退變髓核組織中MMP-9代謝活躍，與椎間盤退變、突出密切相關。Omlor等[13]發現MMP-13基因表達在椎間盤退變過程中上調。亦有研究[14]發現，退變椎間盤的炎性因子可以上調MMP-13的表達，MMP-13的異常表達可導致椎間盤髓核細胞外基質的過度降解，推測MMP-13在椎間盤退變過程中起著非常關鍵的作用。本研究結果發現，隨著改良Thompson分級級數的升高，MMP-13 mRNA、蛋白在椎間盤髓核組織中的表達不斷升高，但不同改良Thompson分級椎間盤髓核組織中MMP-7、9表達比較差異無統計學意義。

有研究[15]發現，骨關節炎模型小鼠關節軟骨中增加的HtrA1與MMP-13有關。本研究結果發現，HtrA1 mRNA與MMP-1、3、13 mRNA表達呈正相關。最近有研究表明，HtrA1能降解纖維連接蛋白，纖維連接蛋白的降解物則可增加MMPs的產量[7]。推測HtrA1與MMP-1、3、13可共同作用于椎間盤，引起相應的椎間盤病變。

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國家自然科學基金資助項目(81601931)；江蘇省自然科學基金資助項目(BK20150475)；鎮江市重點研發計劃-社會發展資助項目(SH2015085)。

黃永輝(E-mail: huangyh8855@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.22.031

R681.5

B

1002-266X(2017)22-0083-03

2016-11-09)