不同水平血尿酸對大鼠學習記憶能力的影響

劉睿，王偉，殷小平

(1南昌大學瑪麗女王學院，南昌 330006；2南昌大學第一臨床醫學院；3南昌大學第二附屬醫院)

不同水平血尿酸對大鼠學習記憶能力的影響

劉睿1，王偉2，殷小平3

(1南昌大學瑪麗女王學院，南昌 330006；2南昌大學第一臨床醫學院；3南昌大學第二附屬醫院)

目的 觀察不同水平血尿酸對大鼠學習記憶能力的影響。方法 將48只大鼠隨機分為對照組、輕度組、中度組、重度組各12只，后三組采用腹腔注射氧嗪酸鉀鹽的方法制備不同水平的高尿酸血癥(HUA)動物模型，對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水，均連續注射給藥28 d。采用Morris水迷宮試驗觀察各組大鼠的學習記憶能力，化學發光法檢測大鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)，免疫組織化學法、酶聯免疫吸附試驗觀察大鼠海馬區β-淀粉樣蛋白1-42(Aβ1-42)表達情況。結果 對照組、輕度組、中度組、重度組大鼠潛伏期分別為(19.6±5.7)、(39.1±6.5)、(36.2±5.6)、(33.7±8.2)s，穿越平臺次數分別為(3.2±0.8)、(2.0±0.6)、(2.1±0.4)、(2.3±0.5)次，輕度組、中度組、重度組與對照組相比，P均<0.01。對照組、輕度組、中度組、重度組大鼠血清SOD活性分別為(403.9±16.3)、(356.9±22.0)、(372.9±15.7)、(382.1±16.2)U/mL，海馬組織Aβ1-42表達陽性細胞數分別為(8.5±2.3)、(70.6±20.5)、(47.5±11.2)、(30.7±7.9)個，海馬組織Aβ1-42相對表達量分別為(11.1±3.1)、(46.9±6.3)、(40.8±5.3)、(35.6±5.6)pg/mg，兩兩相比，P均<0.05。結論 高于正常的不同水平血尿酸均可導致大鼠學習記憶能力下降，但隨著血尿酸水平的升高大鼠學習記憶能力下降程度減輕，其機制可能與尿酸的抗氧化及促氧化雙重特性有關。

尿酸；學習記憶能力；β-淀粉樣蛋白；超氧化物歧化酶

高尿酸血癥(HUA)是代謝性疾病、心腦血管疾病的重要危險因素[1,2]。Schretlen等[3]研究發現，生理范圍內高水平的血尿酸也可能增加老年人認知功能障礙的風險，降低尿酸水平會減少認知障礙的發生。而Al-khateeb等[4]研究發現，低水平血尿酸與阿爾茨海默病(AD)的認知功能有關，低水平血尿酸可能對AD的發生發展起一定作用。因此，尿酸對于AD是保護性因素還是危險因素目前仍不明確[5]，尿酸水平對于認知障礙的影響及其機制需要進一步研究。β-淀粉樣蛋白1-42(Aβ1-42)異常沉積是AD病理改變的中心環節，是形成老年斑的主要成分，其含量高低與學習記憶能力密切相關[6]。超氧化物歧化酶(SOD)是人體內重要的抗氧化劑，可反映體內應激狀態[7]。2015年7月～2016年10月，本實驗擬建立不同濃度的持續性HUA大鼠模型，觀察不同水平血尿酸對大鼠海馬區Aβ1-42表達、學習記憶及血清抗氧化功能的影響，探討水平血尿酸與學習記憶功能的關系及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑 南昌大學動物實驗中心提供的清潔級健康雄性Wistar大鼠48只，體質量(220±10)g，實驗條件下自然飲水、飲食，適應性飼養1周后進行實驗。氧嗪酸鉀鹽購于山東中科泰斗化學有限公司，Aβ1-42抗體購于北京博奧森生物技術有限公司，尿酸、SOD檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 動物分組與HUA模型的建立 將所有大鼠隨機分為對照組、輕度組、中度組、重度組各12只。參考孟笑瑋等[8]的方法用蒸餾水配制氧嗪酸鉀，輕、中、重度組大鼠分別給予150、300、450 mg/kg的氧嗪酸鉀腹腔注射，制備不同水平的HUA模型，對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水，均連續注射給藥28 d。各組大鼠在實驗條件下自然飲水、飲食。對照組、輕度組、中度組、重度組大鼠血尿酸水平分別為(47.7±6.7)、(248.7±16.9)、(274.3±21.1)、(300.1±16.7)μmmol/L，各組間兩兩相比P均<0.05，HUA大鼠模型制備成功。

1.3 大鼠學習記憶能力觀察 造模后第28天采用Morris水迷宮試驗進行空間記憶能力測定。實驗每天分上下午2個時間段，每天訓練4次，每次訓練隨機找入水點，將大鼠面向池壁放入水池，所有大鼠每次訓練取同一入水點。記錄大鼠90 s內從入水找到平臺的時間即逃避潛伏期,在平臺上停留超過2 s表示尋臺成功。尋臺失敗則逃避潛伏期記作90 s。第5天進行空間探索試驗，移除平臺，任選一個入水點，記錄其在90 s內穿越原平臺的次數。

1.4 大鼠血清SOD檢測 各組大鼠于學習記憶能力檢測結束后應用斷尾采血法采集大鼠血液3 mL,經室溫自然凝血、離心分離提取上清液,置于-30 ℃待測。采用化學發光法檢測大鼠血清SOD，檢測方法按照試劑盒說明進行。

1.5 大鼠海馬組織Aβ1-42檢測 ①免疫組織化學檢測。行為學檢測結束后常規灌注取材，常規脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、連續冠狀切片，片厚5 μm。免疫組織化學染色用SP法，按照說明書進行操作。DAB顯色，鏡下觀察顯色情況。結果評定：海馬組織Aβ1-42陽性表達表現為細胞膜及胞質呈棕黃色顆粒。每只大鼠選取相似平面切片5張，應用網格目鏡測試，在40×10倍光鏡下計數單位面積內Aβ1-42陽性表達的細胞數目，每張切片分別選取雙側海馬視野各2個，其均數作為Aβ1-42陽性細胞的數目。②酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定。冰上迅速取出腦組織分離海馬，以生理鹽水制成10%的腦組織勻漿，用低溫離心機離心后，吸取上清液，按試劑盒要求測定大鼠腦組織Aβ1-42表達。

2 結果

2.1 各組大鼠學習記憶能力比較 見表1。

表1 各組大鼠學習記憶能力比較

注：與對照組相比，*P<0.01。

2.2 各組大鼠血清SOD活性比較 對照組、輕度組、中度組、重度組大鼠血清SOD活性分別為(403.9±16.3)、(356.9±22.0)、(372.9±15.7)、(382.1±16.2)U/mL，兩兩相比，P均<0.05。

2.3 各組大鼠海馬組織Aβ1-42表達比較 對照組、輕度組、中度組、重度組大鼠海馬組織Aβ1-42表達陽性細胞數分別為(8.5±2.3)、(70.6±20.5)、(47.5±11.2)、(30.7±7.9)個，兩兩相比P均<0.05。對照組、輕度組、中度組、重度組大鼠海馬組織Aβ1-42相對表達量分別為(11.1±3.1)、(46.9±6.3)、(40.8±5.3)、(35.6±5.6)pg/mg，兩兩相比P均<0.05。

3 討論

HUA是一種由體內嘌呤代謝紊亂引起的疾病，主要臨床表現為血清尿酸水平的升高，該病與遺傳、生活方式、飲食習慣及經濟水平密切相關。《無癥狀高尿酸血癥合并心血管疾病診治建議中國專家共識》指出，HUA是心腦血管病的獨立危險因素之一。近年來研究發現，尿酸水平與認知障礙密切相關，但HUA對認知功能影響的研究結果并不一致[9]。Vannorsdall等[10]研究結果發現，高水平血尿酸與操作記憶、運算速度和語言流暢性記憶有關，缺血性腦白質損害在血尿酸和認知功能障礙之間起重要作用，高水平血尿酸可間接導致海馬缺血缺氧而導致認知功能損害。尿酸是一種重要的生理性的天然抗氧化劑，具有抗氧化應激和保護多巴胺能神經元的作用，還可以增強SOD活性，防止細胞過氧化，延長其生存[11]。臨床研究發現AD和輕度認知障礙患者血尿酸處于較低水平，高尿酸水平輕度認知障礙患者進展為AD的速度減慢[12]。動物實驗發現，尿酸具有改善AD大鼠空間學習記憶能力作用，一定的尿酸水平能夠保護認知功能，其機制與抗氧化應激有關[13]。但也有動物實驗發現，在維持高尿酸后，大鼠海馬SOD等氧化應激指標活性增強，但對認知功能無明顯影響[11]。尿酸在體內是作為還原劑保護細胞還是作為氧化劑介導細胞損傷目前尚無定論。

Morris水迷宮試驗可檢測動物對空間位置覺和方向覺的學習記憶能力，平均逃避潛伏期越短學習能力越強，跨越平臺次數越多記憶能力越強。氧化損傷在AD的發生和發展中發揮重要作用，目前認為記憶減退的重要原因包括抗氧化酶活性的降低，自由基的積累及由此導致的氧化應激損傷。SOD活性高低間接反映了機體清除自由基的能力。海馬被認為是構成學習記憶能力的關鍵部位。Aβ1-42是AD細胞核中老年斑的始動因子和主要成分，海馬Aβ1-42增多與認知功能密切相關[13,14]。本研究結果表明，與對照組相比，輕度組、中度組、重度組大鼠血清SOD活性降低、海馬組織中Aβ1-42表達上調、學習記憶能力下降，隨著血清尿酸水平的進一步升高，SOD活性上升、海馬組織中Aβ1-42的表達下降，學習記憶能力也有所提高，但輕、中、重度組大鼠學習記憶能力比較無統計學差異?？梢姡蛩崴脚c學習記憶能力密切相關，高于正常水平的血尿酸可能為AD的危險因素，但隨著血尿酸水平的進一步升高，又可以降低AD的危險性。其機制可能與尿酸的抗氧化及促氧化雙重特性有關。本研究為AD的預防和治療提供了新的依據。

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殷小平(E-mail: xiaopingbuxiao@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.22.011

R338.64

A

1002-266X(2017)22-0033-03

2016-12-10)