廣東省原住口腔扁平苔蘚患者非刺激全唾液蛋白組學研究

劉廣昌　陳紅艷　楊永平　嚴海超　郭健　羅罡　劉鳳玲

【摘要】 目的：利用雙向熒光差異凝膠電泳-質譜分析技術，研究廣東省原住口腔扁平苔蘚患者非刺激全唾液蛋白豐度變化。方法：選取本院2016年1-12月收治的15例口腔扁平苔蘚患者為研究組，15例正常者為對照組，收集兩組患者的唾液，提取唾液的總蛋白，通過雙向熒光差異凝膠電泳分離蛋白質，熒光掃描尋找差異蛋白質，利用質譜分析技術對差異蛋白質進行分析。結果：SDS-PAGE顯示所有樣品的蛋白條帶清晰，無空缺條帶，無明顯蛋白丟失現象。經2-D DIGE分離檢測，兩組唾液蛋白樣品的總蛋白整體分布相似，重復性較好，研究組與對照組平均唾液蛋白質點數分別為（1596±207）個和（1603±164）個。質譜分析鑒定兩組唾液蛋白存在五個差異比較明顯的蛋白質，即分泌性IgA、鋅α2糖蛋白、碳酸酐酶6、唾液淀粉酶和血清白蛋白，且研究組唾液蛋白中分泌性IgA表達下調，其余四種差異蛋白均表達上調（P<0.01）。結論：分泌性IgA、鋅α2糖蛋白、碳酸酐酶6、唾液淀粉酶和血清白蛋白五種差異蛋白，可能與口腔扁平苔蘚的發生及發展密切相關，可為今后的藥物選擇與治療方案制定提供依據。

【關鍵詞】 口腔扁平苔蘚； 唾液蛋白； 雙向熒光差異凝膠電泳； 質譜分析

Non-stimulated Total Salivary Proteomics of Oral Lichen Planus in Guangdong Province/LIU Guang-chang，CHEN Hong-yan，YANG Yong-ping，et al//Medical Innovation of China，2017，14（16）：128-131

【Abstract】 Objective：To study the abundance change of non-stimulated total salivary protein in oral lichen planus patients in Guangdong province by two dimensional fluorescence difference gel electrophoresis（2-D DIGE）-mass spectrometry.Method：From July 2016 to December 2016，15 patients with oral lichen planus in our hospital were selected as the study group，15 normal subjects were selected as the control group. Saliva of the two groups was collected for the study.The total proteins of saliva were extracted and the proteins were separated by two-dimensional fluorescence differential gel electrophoresis.The differential proteins were detected by fluorescence scanning，and the differential proteins were analyzed by mass spectrometry.Result：SDS-PAGE showed that the protein bands of all the samples were clear and there was no vacancy band and no protein loss.The total protein distribution of the salivary protein samples was similar and reproducible by 2-D DIGE.The average number of salivary protein spots in the study group and control group were （1596±207） and （1603±164）cases respectively.Mass spectrometry analysis showed that there were five significant differences in salivary proteins，secreted IgA，zinc α-2-glycoprotein，carbonic anhydrase 6，salivary amylase and serum albumin.The expression of secretory IgA in the saliva protein of the study group was down-regulated， and the other four proteins were all up-regulated（P<0.01）.Conclusion：Five differentially expressed proteins，incliuding secretory IgA，zinc α-2-glycoprotein， carbonic anhydrase 6，salivary amylase and serum albumin，may be closely related to the development and progression of oral lichen planus，which can provide basis for future drug selection and treatment plan.

【Key words】 Oral lichen planus； Salivary protein； Two dimensional fluorescence difference gel electrophoresis（2D-DIGE）； Mass spectrometry

First-authors address：Dalang Hospital of Dongguan，Dongguan 523770，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.16.037

口腔扁平苔蘚（OLP）是臨床上一種常見的慢性口腔黏膜病，30～60歲為好發年齡，兒童和老人少見，女性略多于男性[1]。OLP可長期反復發作，因長期糜爛病損易導致癌變，世界衛生組織將其列入癌前狀態[2]。OLP目前發病機制尚不明確，臨床尚無特別有效的治療方法。雙向熒光差異凝膠電泳（2D-DIGE）技術，是利用電荷和分子量的差異分離蛋白質混合物，并通過多通道激光掃描分析不同蛋白質的第二向SDS-PAGE凝膠圖像[3-4]。與以往的雙向電泳技術相比，重復性好，靈敏度高。本研究采用雙向熒光差異凝膠電泳-質譜分析技術，通過對本地區口腔扁平苔蘚患者唾液蛋白的篩選找出差異蛋白，為進一步研究本地區OLP的發病機制提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2016年1月-2016年12月收治的15例口腔扁平苔蘚患者為研究組，15例正常者為對照組，收集兩組患者的非刺激性全唾液（whole nnstimulated saliva，WUS）。其中研究組男6例，女9例，平均年齡（42.5±3.4）歲。對照組男7例，女8例，平均年齡（43.1±2.6）歲。兩組患者一般資料比較差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。該研究已經醫院倫理學委員會批準，入選患者知情同意。

1.2 納入及排除標準 兩組入選成員均為廣東省原住人口；均全身無系統性疾病；口腔內均無其他黏膜病變及中、重度牙周炎；婦女均未處于懷孕期及哺乳期；半年內未做過牙周基礎治療；最近3個月均未服用過抗生素；均全口無齲者；均無抽煙者。

1.3 方法

1.3.1 儀器設備 Ettan等電聚焦電泳儀、Ettan垂直板電泳儀、MultiTem P Ⅲ溫控循環水浴、Typhoon 9400多功能熒光掃描系統、Image Quant圖像分析軟件、Decyder Differentialin-gel Analysis V ersion 7.0凝膠分析軟件均為GEHealthcare 公司產品，4800 M ALDI-TOF/TOF質譜為Applied Biosystem 公司產品

1.3.2 樣本的采集 OLP患者在采集前一天晚餐清淡飲食，睡前采用Bass刷牙法進行口腔護理。所有成員均按照Rhodus改良的方法，采集WUS 3 mL置于無菌試管。收集所有樣品后，吸取唾液上清液加入離心管中，隨后加入新鮮配制50%胎牛血清白，迅速用封口膜密封，快速放入-80 ℃超低溫冰箱中冷凍、備用。

1.3.3 樣本的處理 將樣本進行裂解、離心，并取上清液。得到蛋白溶液經2D-Clean up試劑盒純化后用2D-Q uant試劑盒進行定量。每樣品各取50 μg蛋白質，按照CyDye DIGE Fluor minimal labeling kit試劑盒使用說明進行熒光標記。

1.3.4 雙向電泳（全程避光） 將用Cy2、Cy3和Cy5標記的樣品混合在一支離心管，加入等體積的2×sample buffer，用移液器吸打混勻后避光、冰上放置10 min。加入一向電泳水化液至450 L，混勻。將上述溶液加入Holder中，小心置入24 cm膠條（pH 3～11），用覆蓋油覆蓋。等電聚焦參數設定為：30 V，12 h；100 V，1 h；1000 V，1 h；梯度升壓至8000 V，2 h；電流控制在50 μA/膠條。等點聚焦后在平衡液1和平衡液2中各平衡15 min。用電泳液輕輕潤洗膠條。然后轉移到第二向已制好的12.5% SDS-PAG E膠上，用0.5%瓊脂糖封頂，進行第二向電泳，二向電泳的參數設定為：3 W/膠條，45 min；17 W/膠條至溴酚藍染料遷移至膠的底部結束電泳。

1.3.5 圖像掃描 用Typhoon 9400熒光掃描儀分別采集Cy2、Cy3和Cy5熒光信號。通過調整PM T，使選定的強信號區域熒光強度在60000～100000并盡量接近，平衡熒光信號。所得圖像用Decyder Differentialin-gel Analysis Version 7.0凝膠分析軟件進行差異蛋白分析。

1.3.6 質譜分析 考馬斯亮藍后挖取感興趣的差異蛋白質點置于離心管中，進一步用胰蛋白酶降解，進行MALDI-TOF/TOF質譜分析，通過Mascot數據搜索鑒定蛋白質。

1.4 統計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組SDS-PAGE蛋白條帶比較 SDS-PAGE結果顯示，所有樣本的蛋白條帶清晰，兩組間蛋白條帶重復性較好，并無明顯蛋白丟失現象。

2.2 兩組2-D DIGE結果比較 經2-D DIGE檢測兩組總蛋白整體分布相似，圖像重復性較好、分辨率比較高，研究組與對照組平均蛋白質點數分別為（1596±207）個和（1603±164）個。

2.3 兩組質譜分析鑒定結果 質譜分析結果顯示，兩組唾液蛋白存在五個差異明顯的蛋白質，即分泌性IgA、鋅α2糖蛋白、碳酸酐酶6、唾液淀粉酶和血清白蛋白，研究組中分泌性IgA表達下調，其余四種差異蛋白表達明顯上調（P<0.01），見表1。

3 討論

口腔扁平苔蘚（OLP）在口腔疾病中比較常見，主要的臨床表現為乳白色斑點，斑細小孤立，排列成環狀、線狀及不規則的網狀，也有些患者出現斑塊、萎縮、丘疹、侵蝕性潰瘍和大皰[5]。目前其發病機制仍不明確，有自身免疫、感染、神經精神因素、細胞因子作用、家族遺傳等學說，也有些人認為藥物因素、內分泌異常、慢性病灶等因素也可誘發本病[6-7]。隨著以蛋白質組學研究為主的后基因組時代的來臨，人們開始從蛋白質組學的角度研究疾病的發生機制[8]。通過差異蛋白質來研究OLP，將更加全面地揭示其發生、發展過程中的重要蛋白質，為深入探討OLP發生機制及臨床診治提供有效信息。

蛋白質組學技術迅速發展，2-D DIGE的出現有效地克服了傳統2-DE技術的弊端，分辨率高，重復性好，減少實驗誤差帶來的影響，使用熒光染料共價標記，可分析微量的蛋白質樣品，靈敏度高[9-10]。唾液中既包含了血液中可以被常規檢測到的所有蛋白、激素、抗體和其他分子標記，還包括許多唾液腺分泌的蛋白質等，可反映身體的健康狀態[11]。OLP的發生會導致唾液中的蛋白質組分發生變化，因此準確全面地檢測患者唾液的蛋白組分表達水平尋找出差異蛋白，對于進一步闡明OLP發病機制具有十分重要的意義。且唾液檢查無創傷，簡單方便，患者易于接受。本研究利用雙向熒光差異凝膠電泳-質譜分析技術，成功篩選并鑒定出OLP患者唾液蛋白中存在分泌性IgA、鋅α2糖蛋白、碳酸酐酶6、唾液淀粉酶和血清白蛋白五種差異蛋白質。

分泌性IgA在唾液中含量較高，與口腔的生理活動功能密切相關，許彥枝等[12]發現，OLP患者唾液蛋白中的分泌性IgA含量明顯降低。本研究中研究組唾液蛋白中分泌性IgA含量明顯低于對照組，與之前的相關報道保持一致，具有臨床意義。這可能是由于當口腔腺體及其周圍黏膜合成和分泌分泌性IgA不足時，唾液中分泌性IgA含量降低，病原體易侵入口腔引起感染[13]。鋅α2糖蛋白作為一種脂解因子，可以促進脂肪細胞的脂質分解，在惡性腫瘤病人體內表達明顯增高，特別是惡病質患者[14]。除了血清和精液，在尿液、唾液、汗液等體液中都能檢測到這種蛋白[15]。本研究中鋅α2糖蛋白在OLP患者唾液蛋白中表達上調，具體的機制有待進一步研究。

碳酸酐酶6具有維持口腔環境pH值平衡的功能[16]。研究發現唾液碳酸酐酶6減少時，齲齒發生率增加。本研究中OLP患者唾液蛋白中碳酸酐酶6增加，可能與口腔內細菌繁殖導致產酸增高有關。近年來，唾液淀粉酶活性檢測的有效性逐漸得到認可，已經成為一種反映人體自主神經系統在壓力及壓力相關刺激下發生變化最為敏感的生物標記物[17]。在高度精神集中運算壓力下，健康人群的唾液淀粉酶分泌會明顯增加。焦慮患者唾液中的唾液淀粉酶活性與焦慮程度明顯正相關[18]。長期的神經情緒緊張焦慮，很有可能誘發OLP，從而引起唾液淀粉酶含量的增加。唾液中的白蛋白主要來自血液，武影[19]等研究發現血清白蛋白在慢性牙周炎患者WUS中的表達上調。這主要是全唾液中含有10%來源的齦溝液成分，在牙周組織炎癥狀態下齦溝液流量增大，進入唾液的成分也可能增高[20]。本研究中研究組血清白蛋白表達上調，可能是由于OLP是一種慢性炎癥性疾病，對局部黏膜產生的刺激影響唾液的分泌，誘發血清白蛋白含量增多所致。

綜上所述，利用雙向熒光差異凝膠電泳-質譜分析技術，篩選出OLP患者唾液蛋白存在的五種差異蛋白，但仍需要通過Western blot等技術進一步驗證。本研究將繼續探索本地區扁平苔蘚患者唾液中蛋白質的代謝變化規律與發病機制，努力為臨床診療提供依據。

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（收稿日期：2016-12-30） （本文編輯：周亞杰）