淺談甲基化抑制劑5-Aza-CdR對肺癌A549細胞株DNA甲基轉移酶1及c-myc、MKi-67、p53基因表達的影響*

彭 峰，彭奕華，張宏華

（韶關市粵北人民醫院呼吸內科，廣東 韶關 512026）

近年來，肺癌的發病率逐年上升，嚴重地威脅到了人們的健康生活，作為一種常見的惡性腫瘤，其中的病因還沒有完全明確，其中的發展變化涉及的是一個多階段的復雜過程[1]。在肺癌發生的過程中，只要涉及的環節有抑癌基因的活性降低、癌基因的表達變得活躍、DNA的修復基因缺失，任何一個環節都有可能造成肺癌的發生，研究發現[2]：發生腫瘤的主要的原因是基因啟動子區域的甲基化過程發生了異常的變化，甲基化修飾出現異常的情況時，基因的表達、細胞的分化及繁殖都會出現異常，嚴重的威脅到了人們的正常生活。

本文主要研究了甲基化抑制劑5-氮雜-2'脫氧胞苷 (5-Aza-CdR)對肺癌A549細胞株DNA甲基轉移酶1(DNMT1)及c-myc、MKi-67、p53基因表達的影響，其中采用的是分組對比的研究方式，通過研究發現采用甲基化抑制劑5-Aza-CdR可以降低肺癌A549細胞中的DNMT1及c-myc、MKi-67、p53基因表達量，升高p53基因的表達量，其中具體的數據分析如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

在進行研究的過程中選取肺癌A549細胞株作為主要的研究對象，所用到的材料有甲基化抑制劑5-Aza-CdR，采用的培養基為1640，采用的引物主要有：

DNMT1：上游5’ ATCTAGCTGCCAAACGGAGG-3’

下游5’ CTGAATGCACTTGGGGAGGGT-3’，191 bp；c-myc：上游5’ TACAACACCCGAGCAAGGAC-3’

下游5’ TTCTCCTCCTCGT-CGCAGTA-3’，259 bp;MKi-67：上游5’ ACACTCCACCTGTCCTGAAG-3’

下游5’ AG-GCAGGTTGCCACTC-TTTC-3’，251 bp;p53：上游5’ TCTTGTTCCCCACTGACAGC-3’

下游 5’ GTGCAG-GCCAACTTGTTCAG-3’，159 bp;β-action：上游5’ TGGCACCCAGCACAATGAA-3’

下游5’CTAAGT-CATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’，186bp;SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，DNMT1 及 c-myc、MKi-67、p53 單克隆抗體及二抗。

1.2 方法

1.2.1 A549細胞株的培養及傳代：在對A549細胞株進行培養的過程中，選取的培養液為濃度是10%的胎牛的血清1640培養溶液，放入適宜的環境中對肺癌A549細胞株進行培養。在培養的細胞群中選擇細胞的匯合率達到了75%左右的細胞，對與貼壁緊密并且牢固的細胞優先選擇，保證細胞處于一個良好的生長狀態，這樣可極大的保證傳代細胞的質量，傳代的過程中，結合實際的情況選擇的時間為3d左右，將最終操作完成的傳代細胞進行收集，一部分為觀察組使用，另一部分為對照組，在觀察組中加入5-Aza-CdR，其中的濃度為5μmol/L，對照組不加入任何藥物。

1.2.2 采用FQ-PCR對mRNA的表達進行檢測：將合成的cDNA作為模板，并且按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ說明書上的內容進行操作，其中引物上游為0.8 μL，下游為ROX Reference Dye（50×）0.40 μL，其中 cDNA 模板 2 μL，ddH2O 6 μL，擴增參數為 95℃ 30 min；95℃ 5 s；60℃ 30 s，在循環結束之后進行熒光采集檢測。

1.2.3 檢測蛋白表達：對蛋白的濃度進行檢測，主要采用的是蛋白裂解液，并且進行電泳、轉膜，需要的時間大約為1h左右，封閉放入溫室后進行孵育工作，并進行顯色及曝光的處理。

1.3 統計學方法

各個實驗進行獨立重復的三次操作，統計學軟件SPSS16.0分析數據，計量資料利用均數±標準差（±s）表示，組間比較行t檢驗。

2 結果

2.1 A549細胞株的培養及傳代

對兩組的細胞進行藥物處理3d之后，觀察兩組細胞的生長情況，研究發現觀察組的細胞生長受到明顯的抑制，具體的數據分析如表1。

表1 兩組DNMT1及c-myc、MKi-67、p53表達量對比（±s）

表1 兩組DNMT1及c-myc、MKi-67、p53表達量對比（±s）

項目mRNA組別觀察組對照組tP--DNMT1 0.32±0.01 1.03±0.05 82.377 c-myc 0.32±0.02 1.01±0.02 144.324 p53 1.56±0.03 0.85±0.07 22.528＜0.05 MKi-67 0.25±0.01 0.97±0.02 190.494

2.2 兩組細胞DNMT1及c-myc、MKi-67、p53蛋白表達

通過研究發現觀察組的DNMT1及c-myc、MKi-67的蛋白表達量明顯的低于對照組，p53蛋白表達量明顯高于對照組，具體的數據分析如表2。

表2 兩組細胞DNMT1及c-myc、MKi-67、p53蛋白表達（±s）

表2 兩組細胞DNMT1及c-myc、MKi-67、p53蛋白表達（±s）

項目蛋白組別觀察組對照組t P--DNMT1 0.42±0.02 1.20±0.05 85.689 c-myc 0.43±0.02 1.30±0.10 4.678 p53 1.90±0.05 0.71±0.01 138.068＜0.05 MKi-67 0.32±0.02 0.50±0.08 12.917

3 討論

作為一種DNA的甲基轉移酶抑制劑，5-Aza-CdR能夠迅速的與DNA的甲基轉移酶進行結合，使得酶的活性降低，通過降低甲基化的水平來對基因的表達進行調整，因此在由于啟動子甲基化造成的基因表達的不充分甚至缺失的疾病中，經常采用5-Aza-CdR來進行治療[3]。c-myc是一種可異位基因，同時也是myc基因家族中的核心組成部分，它是一種可調節的基因，主要作用使細胞進行不斷的生長、繁殖，并且可以促使細胞分裂，與腫瘤的發生有著密切的關系，該基因在正常的細胞轉為癌細胞的過程中起著重要的作用[4]。MKi-67作為一種核抗原與增殖細胞有著密切的關系，如細胞的有絲分裂，在繁殖的過程中必不可少，該細胞的表達范圍除了G0期以外的各個周期的細胞，成為了判斷細胞增殖活性的重要的指標，該蛋白是唯一一個與細胞的周期及增殖活動相關的蛋白。大量的臨床試驗研究表明[5]，DNMTI在癌細胞中起著很重要的作用，DNMT1作為DNA甲基轉移酶的主要的部分，可以對DNA進行復制及修復，它不僅對DNA甲基化的關鍵酶起著催化的作用，而且還有很好的維持DNA甲基化的作用。一般發生癌變腫瘤的原因是，DNMTI的表達增強，致使患者體內的抑癌基因CpG導致DNA異常甲基化，使其不能正常的表達，最終發生癌變。一般在胃癌、肺癌以及卵巢癌中DNMTI的表達最高，并且可以作為癌變基因的一個重要診斷依據[6]。P53也屬于人體中的抑癌基因，它有著轉靈激活的作用，這種基因如果失活很可能會形成腫瘤，并且它是目前臨床上公認的抑癌基因之一，應該引起關注[7]。

本文研究的主要內容是甲基化抑制劑5-Aza-CdR對肺癌A549細胞株DNMT1及c-myc、MKi-67、p53基因表達的影響，采用分組對照的方式進行研究，觀察組細胞中采用5-Aza-CdR藥物處理，對照組中不采用任何藥物處理，通過一段時間的處理之后研究發現，觀察組的細胞生長受到的明顯的抑制，并且觀察組中的DNMT1及c-myc、MKi-67的蛋白表達量明顯的低于對照組，p53蛋白表達量明顯高于對照組，主要的作用機制大概是5-Aza-CdR一方面是使得細胞發生了去甲基化[8]，另外一方面可能是甲基化等到了抑制，癌基因的表達不再活躍，使得抑癌基因的表達更加充分，加速了腫瘤細胞的凋亡，并且使得腫瘤細胞的繁殖率明顯的降低，腫瘤細胞的負調控機制不斷的加強，與此同時激活了抑癌基因的表達，從而有效控制腫瘤基因的表達[9]。其中研究還發現[10]，DNA甲基轉移酶1以及c-myc、MKi-67、p53都是肺癌發生的關鍵因子，任何一種因子的表達發生異常情況時，都有可能促使腫瘤的生長及繁殖，5-Aza-CdR通過控制基因啟動子區的過度甲基化，從而控制腫瘤的進一步的惡化[11]。

綜上所述，甲基化抑制劑5-Aza-CdR明顯的降低了肺癌A549細胞中的DNMT1及c-myc、MKi-67、p53基因表達量，使得p53基因表達量升高，抑制了癌基因的表達，使得腫瘤細胞的生長得到有效的控制，為采用去甲基化的方式進行治療肺癌提供了有力的依據[12]。

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