電針頸夾脊穴對頸型頸椎病模型兔椎間盤軟骨細胞MMP-3、TGF-β1的影響

唐 學，肖靚宜，吳清明*，鐘茜云，陳 翼，何可旺，胡曉妹，伍果美

(1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208;2.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙 410007)

電針頸夾脊穴對頸型頸椎病模型兔椎間盤軟骨細胞MMP-3、TGF-β1的影響

唐 學1，肖靚宜2，吳清明2*，鐘茜云1，陳 翼1，何可旺1，胡曉妹1，伍果美1

(1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208;2.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙 410007)

目的 采用ELISA法觀察電針頸型頸椎病（CS）模型兔對其椎間盤軟骨中基質金屬蛋白酶-3（MMP-3）、轉化生長因子-β1（TGF-β1）含量的影響，從而探討電針治療頸型CS可能的作用機制。方法 將18只新西蘭純種兔按隨機數字表法隨機分為空白組、模型組、治療組，每組6只，除空白組外其余兩組采用復合病因造模法造模，連續10周。造模成功后，治療組予電針治療，其他兩組正常飼養，連續4周。耳緣靜脈注射空氣栓塞處死各組動物，取C4-7椎間盤組織，分離出軟骨終板，采用ELISA法觀察椎間盤軟骨中MMP-3、TGF-β1的含量。結果 與空白組比較，模型組兔椎間盤軟骨細胞中MMP-3、TGF-β1含量均升高，差異具有顯著統計學意義 (P＜0.01)。與模型組比較，治療組兔椎間盤軟骨細胞中MMP-3含量降低，TGF-β1含量升高，差異具有顯著統計學意義(P＜0.01)。結論 電針頸型CS模型兔頸夾脊穴可以降低其椎間盤軟骨細胞中MMP-3含量，抑制其對軟骨細胞外基質（ECM）的降解，維持血竇-軟骨終板界面彌散營養物質的能力，延緩或阻止椎間盤退變的發生；同時可以升高TGF-β1含量，促進ECM的合成，對椎間盤進行修復，維持椎間盤軟骨終板的正常形態結構，減輕早期椎間盤退變的程度。

電針；頸夾脊穴；頸型頸椎病；軟骨細胞外基質；基質金屬蛋白酶3；轉化生長因子-β1

頸椎病（cervical spondylosis，CS）又稱頸椎綜合征，是指由于頸椎間盤退行性變、頸椎骨質增生以及頸部損傷等原因引起脊柱內外平衡失調，刺激或壓迫頸部脊髓、神經根、椎動脈或交感神經，而引起一系列癥狀的臨床綜合征[1]。該病常伴有頭暈頭痛、肢體無力、麻木和疼痛等癥狀，嚴重者可見雙下肢痙攣、行走困難，甚至四肢麻痹，大小便障礙，出現癱瘓，嚴重影響患者的生活質量。其中，頸型頸椎病亦稱局部型頸椎病，具有頭、肩、頸、臂的疼痛及相應的壓痛點，頸肩部活動輕度受限，X線片上沒有椎間隙狹窄等明顯的退行性改變，但可以有頸椎生理曲線的改變，椎體間不穩定及輕度骨質增生等變化。此型在臨床上極為常見，實際上是頸椎病的最初階段，是最早期的頸椎病。據流行病學調查統計[2]，中國頸椎病患者的發病率約為3.8%～17.6%，全國約有5 000萬到15 000萬人患有此病，且每年新增頸椎病患者大約100萬人。目前頸型頸椎病的西醫治療主要是保守療法，包括牽引、理療和口服消炎鎮痛藥物等方法，但療效有限，不能從根本上治療頸椎病，并且長期口服藥物副作用較大。近年有關研究表明：電針治療頸型頸椎病具有多途徑良性調節、早期起效迅速、遠期療效穩定、總有效率高等優勢。通過查找歷年相關文獻資料，我們探討電針頸型CS模型兔對其椎間盤軟骨中基質金屬蛋白酶-3（matnix metalloproteinases-3,MMP-3）、轉化生長因子-β1（transforming gravth factor-β,TGF-β1）含量的影響，探究二者對維持椎間盤軟骨細胞處于合成與分解代謝的動態平衡狀態，穩定成熟軟骨細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的結構和功能，改善椎間盤營養障礙，治療頸型CS可能的作用機制。這將為臨床合理應用電針治療本病提供重要的理論依據。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

湖南中醫藥大學動物實驗中心提供的健康普通級新西蘭純種兔18只(動物合格證號：SCXK(湘)2015－0004)，每只日齡 70 d，體質量 1.5～2.0 kg，雌雄各半。飼養環境：每只分籠圈養于動物中心實驗室，自然采光，溫度20～25℃，相對濕度50%～70%。

1.2 實驗儀器

無菌針灸針（安迪牌，0.25 mm×40 mm）；電針儀（華佗牌，SDZ-II型）；ELISA 試劑盒（TGF-β1：L160322635 48T；MMP-3：L160318424 48T）； 臺式冷凍離心機(湘儀，TGL－16)；酶標儀(匯松，MB－530)；全自動酶標洗板機(匯松，PW－812)；恒溫振蕩器(強樂，THZ－C)；自制低頭位兔子固定架。

2 方法

2.1 穴位定位

參照新世紀全國高等中醫院校規劃教材《實驗針灸學》及中國針灸學會實驗針灸分會制定的《動物針灸穴位圖譜》量取。選穴：頸4～7夾脊穴，即第4至第7頸椎棘突下旁開0.5 cm。

2.2 動物造模

將18只新西蘭純種兔按隨機數字表法隨機分為空白組、模型組、治療組，每組6只，除空白組外其余兩組采用復合病因造模法 （低頭位固定+風寒濕刺激）造模[3]，將模型組、治療組各6只新西蘭純種兔置于自制改良后的簡易兔盒中,剔去頸部毛發，敷以自制保濕冰袋,調節保濕冰袋松緊并將其下端扣住兔盒,使兔的頸部成低頭屈曲位60°,將吹風機出風口對準兔頸部，風力5檔。每次造模時間為2 h，每天上午與下午各造模1次，共4 h，持續10周。

2.3 干預方法

治療組兔頸后部剃毛后取穴定位，皮膚常規消毒后，直刺 0.5～0.8 cm，進針后不施以手法刺激，連接華佗牌SDZ-II型電針儀，正極連接雙側頸4夾脊穴，負極連接雙側頸7夾脊穴，予疏密波，頻率2-100 Hz，電壓2-4 V，強度至肌肉輕微抖動，留針30 min，每天1次，2周為1療程，間隔1 d進行下1療程，共2個療程。模型組與空白組均不予治療處理。三組兔均正常飼養。

2.4 標本的采集及處理

`耳緣靜脈注射20 mL空氣栓塞處死動物，迅速切開項后正中皮膚，分離肌肉，取下整個頸段脊椎，沿上下椎骨緣分別取出C4/5、C5/6、C6/7椎間盤組織，分離出軟骨終板，用生理鹽水反復沖洗干凈，存于-80℃超低溫冰箱備用。

2.5 觀察指標及方法

2.5.1 頸后肌肉硬度 造模結束后，仔細觀察三組兔頸后肌肉硬度變化。

2.5.2 影像學觀察 造模結束后，三組兔均行頸部正位片，進行影像學觀察。

2.5.3 組織形態學觀察 將軟骨終板組織放入4%多聚甲醛中固定48 h，5%硝酸中脫鈣，常規處理后，石蠟包埋切片，5 μm厚，HE染色，光鏡下觀察軟骨細胞形態結構。

2.5.4 細胞因子測定 頸型CS模型兔椎間盤軟骨細胞相關細胞因子的測定：將軟骨終板組織稱質量，超聲波粉碎。加入PBS研磨制成勻漿，3 500 r/min離心 10 min，取上清液 500 μL,濃度為 0.01 mol/L。采用ELISA法測定MMP-3、TGF-β1的含量。

2.6 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行處理，均以P＜0.05為有統計學意義。計量資料用“±s”表示，均進行正態性和方差齊性檢驗。滿足正態性者，多組計量資料采用單因素方差分析，方差齊時選擇LSD法，方差不齊時選擇Dunnett T3法；不滿足正態性者，選擇秩和檢驗。

3 結果

3.1 兔頸后肌肉硬度變化

空白組兔頸后肌肉柔軟有彈性，未觸及明顯緊張感。模型組、治療組兔在造模過程中，頸后肌肉逐漸變得痙攣、僵硬，撥動部分家兔頸后肌時，指下猶如撥琴弦感；造模結束時，模型組、治療組兔頸后肌肉明顯，呈條索狀肌痙攣。

3.2 影像學觀察

造模結束后，三組兔均行頸部正位片，空白組兔頸椎正常生理曲度存在，椎體排列整齊，邊緣光滑完整，頸椎各椎體間隙相等。模型組、治療組兔子頸椎生理曲度改變，椎體排列不規整，椎體間隙降低，椎體邊緣有輕度骨質增生。詳見圖1。

圖1各組兔頸部正位片

3.3 光鏡下觀察軟骨細胞形態結構

經14周不同處理后取材行HE染色，空白組可見大量呈橢圓形的正常軟骨細胞結構,核膜完整,核染色質均勻分布，線粒體無腫脹,空泡變性細胞少見,軟骨陷窩存在，膠原纖維排列緊密整齊。模型組可見大量空泡變性軟骨細胞，大量固縮軟骨細胞,甚至溶解消失；膠原纖維排列極不規整,甚為松散,并且部分膠原纖維溶解。治療組大部分軟骨細胞基本顯示正常結構,軟骨陷窩存在，有少量軟骨細胞變性；膠原纖維排列基本規整,有少量膠原纖維排列紊亂、松散，未見膠原纖維溶解。詳見圖2。

圖2光鏡下軟骨細胞形態結構觀察(HE，×400)

3.4 各組兔椎間盤軟骨細胞中MMP-3、TGF-β1的含量

與空白組比較，模型組兔椎間盤軟骨細胞中MMP-3、TGF-β1含量均升高，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)，說明造模處理后兔椎間盤發生椎間盤退變，造模成功。與模型組比較，治療組兔椎間盤軟骨細胞中MMP-3含量降低，TGF-β1含量升高，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)，說明電針治療能降低兔椎間盤軟骨細胞中MMP-3含量，升高兔椎間盤軟骨細胞中TGF-β1含量。見表1。

表1各組兔椎間盤軟骨細胞中MMP-3、TGF-β1含量的比較 (n=6，±s，μg/μL)

表1各組兔椎間盤軟骨細胞中MMP-3、TGF-β1含量的比較 (n=6，±s，μg/μL)

注：與空白組比較，▲▲P＜0.01;與模型組比較，★★P＜0.01。

組別空白組模型組治療組MMP-3 7.53±0.58 17.49±1.07▲▲3.14±0.45★★TGF-β1 7.27±0.99 9.46±1.60▲▲21.20±0.47★★

4 討論

現在公認對頸椎病及其所有臨床表現發生起根本作用的主要因素是頸椎間盤的退變。有研究發現細胞凋亡與細胞增殖之間的不平衡參與了骨性關節炎等退行性疾病的發生發展。盡管細胞凋亡與椎間盤退變的關系近年來逐漸受到重視，但椎間盤細胞凋亡的信號轉導途徑仍不明了，而且對細胞增殖與椎間盤退變的關系則關注很少。

正常椎間盤由纖維環、髓核和軟骨終板構成。來自毛細血管的營養成分在到達椎間盤前必須通過一層致密的軟骨終板。軟骨終板直接與椎體骨髓血竇接觸，椎間盤營養物質轉運主要通過血竇-軟骨終板界面進行，因此，軟骨終板途徑是椎間盤主要的營養途徑[4]。一般情況下，椎間盤軟骨細胞處于合成代謝與分解代謝的動態平衡之中，這種平衡狀態在維持成熟軟骨細胞外基質 （extracellular matrix，ECM）結構和功能中也起主要作用。一旦平衡被破壞，將造成椎間盤營養障礙，出現椎間盤退變[5]。

基質金屬蛋白酶 （matrix metalloproteinases，MMPs）是基質降解酶類中最重要的一種，主要參與細胞外基質的代謝，幾乎能降解ECM的所有成分。MMPs可引起椎間盤基質中蛋白多糖聚合體降解，蛋白多糖含量下降，組成成分（硫酸軟骨素/硫酸角質素比值下降）發生明顯改變，造成髓核失水而喪失其固有的彈性，可直接導致椎間盤生物力學功能的減退和喪失，從而加速椎間盤退變[6]。MMP-3是重要的基質金屬蛋白酶之一，屬于基質降解酶，是椎間盤軟骨細胞降解的關鍵酶，也是降解退變的椎間盤基質的主要酶類。而隨著椎間盤退變的發生及發展，MMP-3在退變的椎間盤中的表達明顯異常[7]。經研究證實，MMP-3與基質退變之間存在密切關系，退變的椎間盤組織產生的MMP-3比正常椎間盤組織要高[8-12]。如果能夠有效抑制MMP-3的合成及活性，則可能降低對軟骨細胞ECM的降解，維持血竇-軟骨終板界面彌散營養物質的能力，延緩或阻止椎間盤退變的發生[13]。

軟骨終板的主要成分是蛋白多糖和膠原，而TGF-β1是蛋白多糖及膠原代謝等椎間盤ECM的重要調節物質之一，在椎間盤退變的病理過程及基因治療中發揮重要作用。蛋白多糖能調節基質膠原間的有效孔徑，控制帶電溶質在椎間盤中的分布和轉運，對保持椎間盤組織和外界環境間的物質交換及防止終板自身的鈣化都具有重要的作用[14]。膠原成分具有抗壓、均勻傳遞應力能力，發揮緩沖、吸收應力的能力，是構成軟骨基質的支架結構，其質和量的改變必然引起軟骨終板承載能力的降低和增加損傷的機會[15]。研究表明，在退變的椎間盤中TGF-β1受體的活性明顯高于正常者，且TGF-β1含量與椎間盤退變程度成正相關[16]；在椎間盤退變早期，TGF-β1通過促進ECM的合成，對椎間盤進行修復，維持椎間盤軟骨終板的正常形態結構，減輕早期椎間盤退變的程度[17-18]。

祖國醫學雖無“頸椎病”的病名，但根據其臨床表現特點，多歸屬于“痹癥”“項痹”“項強”“頸筋急”“項背強”“風傷項急”等范疇。《素問·本臟》云“是故血和則經脈流行，營復陰陽，筋骨強勁，關節清利矣”，說明了中醫治療頸椎病的關鍵在于調節陰陽氣血、強筋骨、利關節為法。對于頸椎病的針灸治療，歷代都有詳細的論述，所取經脈多為足太陽經、手足少陽經、督脈，較之傳統的選經取穴方法，現代臨床治療頸椎病多根據不同的病變部位選取相應節段頸夾脊穴，結合“經絡所過，主治所及”的理論以及腧穴的主治特性進行選穴。頸夾脊穴位于后項部，既是本病的病位所在，又是督脈與足太陽膀胱經經氣外延重疊覆蓋之處，采用電針法處理頸夾脊穴可結合毫針與電生理效應的雙重作用，起到聯絡溝通二脈、調節局部氣血運行、疏理項部經筋肌肉等作用，從而達到治療頸型頸椎病的目的。

本實驗中我們采用ELISA法觀察電針頸型CS模型兔對其椎間盤軟骨中MMP-3、TGF-β1含量的影響，從而探討電針治療頸型CS可能的作用機制。結果顯示：頸型CS模型兔椎間盤軟骨外基質中MMP-3含量升高，破壞軟骨細胞合成代謝與分解代謝的動態平衡，使其難以維持成熟軟骨細胞外基質的結構和功能，造成椎間盤營養障礙，導致椎間盤的退變。另一方面，頸型CS模型兔椎間盤中TGF-β1含量升高，促進ECM的合成，對退變的椎間盤進行修復，減輕早期椎間盤退變的程度。電針頸型CS模型兔頸夾脊穴可以降低其椎間盤軟骨細胞中MMP-3含量，抑制其對軟骨細胞ECM的降解，維持血竇-軟骨終板界面彌散營養物質的能力，延緩或阻止椎間盤退變的發生；同時可以升高TGF-β1含量，促進ECM的合成，對退變的椎間盤進行修復，維持椎間盤軟骨終板的正常形態結構，減輕早期椎間盤退變的程度。本實驗僅作為動物實驗，觀察例數偏少，只選定了頸型CS這一簡單類型，所以關于電針頸夾脊穴對頸型CS的其他神經體液、化學物質和調節機制的作用，有待將來進一步實驗研究。

[1]賈連順.頸椎病的現代概念[J].脊柱外科雜志，2004，2(2)：123-126.

[2]朱立國,于 杰.關于神經根型頸椎病的臨床治療述評[J].醫學信息，2009,22（1）：3-5.

[3]張 欣，李殿寧，李開平，等.無創兔頸型頸椎病動物模型的建立[J].中華中醫藥學刊，2015,33(4)：913-915.

[4]黃宗強,劉尚禮,鄭召民.椎間失穩誘發椎間盤退變的病理學觀察[J].中國矯形外科雜志,2007,15(5)：376-379.

[5]Dudli S,Haschtmann D,Ferguson SJ.Fracture of the vertebral end-plates,but not equienergetic impact load,promotes disc degeneration invitro[J].J Orthop Res,2012,5：809-816.

[6]陳德勝,金群華.基質金屬蛋白酶及其抑制劑與椎間盤源性下腰痛的關系[J].脊柱外科雜志,2005,3(2)：121-123.

[7]陳德勝,金群華,李 燕,等.MMPs抑制劑對退變腰椎間盤中MMP-3 表達的影響[J].中國康復理論與實踐,2006,12(8)：692-693.

[8]Soblajima S,Shimer AL,Chadderdon RC,et al.Quantitative analysis of gene expression in a rabbit model of inter1vertebral disc degeneration by realtime polymerase chain reaction[J].Spine J,2005,5(1)：14-23.

[9]Kato T,Haro Komon HL， et al.Sequential dynamics of in flamematory cytokine,angiogenesis inducing factor and matrix degrading enzymes during spontaneous resorption of the herniated disc[J].J Orthop Res,2004,22(4)：895-900.

[10]曾佳興,梁 斌,尹 東,等.MMP-3、IgG和CD68在青少年與中老年突出腰椎間盤組織中的表達分析 [J].中國脊柱脊髓雜，2013,23(12)：1109-1114.

[11]Bachmeier BE,Nerlich A,Mittermaier N,et al.Matrix metal-loproteinase expression levels suggest distinct enzyme roles during lumbar disc herniation and degeneration[J].Eur Spine,2009,18(11)：1573-1586.

[12]劉 斌,戎利民,曾 春,等.椎間失穩致兔腰椎軟骨終板退變的形態學研究[J].中國臨床解剖學雜志,2009,27（4）：440-443.

[13]張 昭,霍洪軍,楊學軍,等.兔椎間失穩軟骨終板II型膠原變化的相關實驗研究[J].中國誤診學雜志,2008,8（25）：6054-6056.

[14]Ireland D.Molecular mechanisms involved in intervertebral disc degeneration and Potential new treatment strategies[J].Bioscience Horizons,2009,2(l)：83-89.

[15]汪妍霞,王瑞琳,熊光宜,等.退變椎間盤中新生血管與TGF-β1表達的關系及其臨床意義[J].臨床與實驗病理學雜志,2012,28(9)：983-986.

[16]戴啟宇,楊廷桐,于芳芳,等.退行性變椎間盤組織轉化生長因子β1 基因的表達[J].中國組織工程研究,2013,17(24)：4495-4501.

[17]Singh KM,Masuda KM,Thonar E,et al.Age-related changes in the Extraeellular Matrix of nucleus pulposus and anulus fibrosus of human intervertebral disc[J].J SPine,2009,l(34)：10-16.

[18]Cui D,Zhang S,Ma J,et al.Short in terfering RNA targetting NF-kappa B induces apoptosis of hepatic stellate cells and attenuates extracellular matrix produetion[J].Dig Liver Di s.2010,42(11)：813-817.

（本文編輯 匡靜之）

Effects of Electro-acupuncture at Cervical Jiaji Points on MMP-3 and TGF-β1 in Intervertebral Disc Chondrocytes of Cervical Spondylotic Model Rabbits

TANG Xue1,XIAO Liangyi2,WU Qingming2*,ZHONG Qianyun1,CHEN Yi1,HE Kewang1,HU Xiaomei1,WU Guomei1
(1.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;2.The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China)

Objective To observe the effect of electro-acupuncture on the expression of MMP-3 and TGF-β1 in cervical intervertebral disc cartilage in cervical spondylotic(CS)model rabbits,and to explore the possible mechanism of EA treatment.Methods The eighteen New Zealand pure rabbits were randomly divided into blank group,model group and treatment group,six rabbites in each group.Except for the blank group,the other two groups were made by compound etiological modeling method for 10 weeks.After modeling successfully,the treatment group was given electro-acupuncture treatment,the other two groups were given normal feeding,for 4 weeks.The animals in each group were killed by air embolisn complicating injection.The C4-7 intervertebral disc tissue was isolated and the cartilage endplate was isolated.The contents of MMP-3 and TGF-β1 in intervertebral disc cartilage were detected by ELISA.Results Compared with the blank group,the contents of MMP-3 and TGF-β1 in the intervertebral disc chondrocytes of the model group significantly increased (P＜0.01).Compared with the model group,the content of MMP-3 and TGF-β1 in the intervertebral disc chondrocytes of the treatment group significantly decreased (P＜0.01).Conclusion Electro-acupuncture cervical cervicogenic model could decrease the content of MMP-3 in intervertebral disc chondrocytes and inhibit the degradation of ECM in chondrocytes,delay or preventthe diffusion of nutrients in cartilage endplate interface.It also could increase the level of TGF-β1,promote the synthesis of ECM,repair the intervertebral disc,maintain the normal form of cartilage endplate structure,reduce the extent of early disc degeneration.

electro-acupuncture; cervical Jiaji points; neck cervical spo ndylosis; cartilage extracellular matrix;matrix metalloproteinase-3;transforming growth factor-β1

R245.9+7

A

doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2017.06.026

本文引用：唐 學，肖靚宜，吳清明，鐘茜云，陳 翼，何可旺，胡曉妹，伍果美.電針頸夾脊穴對頸型頸椎病模型兔椎間盤軟骨細胞MMP-3、TGF-β1的影響[J].湖南中醫藥大學學報，2017,37（6）：674-678.

2016-09-30

湖南省高校創新平臺開放基金資助項目(15K096)。

唐 學，男,在讀碩士研究生，研究方向：主要從事針灸推拿應用與機制研究工作。

* 吳清明，男，教授，碩士研究生導師，E-mail：qmwu6789@163.com。