祛斑中藥組方干預黑素合成的主效應中藥剖析

陳志春，王英豪，張理平，蘭明金

?

祛斑中藥組方干預黑素合成的主效應中藥剖析

陳志春1，王英豪2，張理平2，蘭明金2

1.福州屏山制藥廠，福建福州 350003；2.福建中醫藥大學藥學院，福建福州 350122

目的 解析祛斑中藥組方干預黑素合成的主效應中藥。方法 采用3×2析因設計，以山楂、當歸、山萸肉為考察因素，各設2水平，分別測定酪氨酸酶活性抑制率、多巴色素自動氧化生成黑素量、多巴自動氧化抑制率，并運用SPSS16.0軟件輔助解析祛斑組方對干預黑素合成不同途徑的主效應中藥。結果 組方中山萸肉對酪氨酸酶活性具有顯著抑制作用（＜0.05），山萸肉、當歸對多巴色素自動氧化生成的黑素量具有極顯著抑制作用（＜0.01），山萸肉、當歸對多巴自動氧化具有顯著抑制作用（＜0.05），山萸肉在組方中貢獻最大。結論 山萸肉為組方中抑制酪氨酸酶活性、多巴色素自動氧化生成黑素量、多巴自動氧化的主效應中藥。

析因設計；酪氨酸酶；黑色素；祛斑中藥復方；效應中藥

1 儀器與試藥

紫外-可見分光光度計（UV-9100，北京瑞利分析儀器公司），電子分析天平（FA20004N，上海精密科學儀器有限公司），數顯水浴鍋（HH.S，上海錦屏儀表有限公司），離心機（Anke TDL80-2B，廠家上海安亭科學儀器廠），微量移液器（PIPETTOR，WKY型，100～500 μL，上海求精生化試劑儀器有限公司），超聲波清洗器（KQ-500E，昆山市超聲儀器有限公司）。

山楂（批號20140505）、當歸（批號20141118）、山萸肉（批號20141023）購于福建中醫藥大學國醫堂，經福建中醫藥大學車蘇容副教授鑒定，分別為薔薇科植物山楂Bge.的干燥成熟果實、傘形科植物當歸（Oliv.）Diels的干燥根、山茱萸科植物山茱萸Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉。酪氨酸酶（SIGMA，CAS9002-10-2，EC232-653-4，USA，MSDS）；左旋多巴（-Dopa，西安潤澤生物技術有限公司，批號060108）；鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、乙醇等試劑均為分析純。

2 方法

2.1 析因試驗設計

參考前期研究結果[1-4]，本試驗選用3×2析因設計表，以山楂、當歸、山萸肉為考察因素，每個因素設2個水平，進行組方設計（見表1），得到析因設計試驗方案（見表2），其中1行為1種組方，按表中各行數值取相應藥味混合即得，共8組。

表1 析因設計因素水平表（g）

表2 析因設計試驗方案

2.2 組方制備

將組方（山楂、當歸、山萸肉等）飲片分別粉碎成粗粉（40目），分別稱取適量粉末于具塞三角瓶中，加入適量乙醇，混勻，浸泡0.5 h，超聲提取（功率500 W，頻率40 kHz）1 h，提取2次，分別過濾，減壓回收乙醇，制得濃度為250 g/L的藥液，備用。

1.2 峨眉武術的歷史演進挖掘 峨眉武術作為中國民族傳統武術流派重要的一支，自其發展之初，便依托以中國著名的峨眉山為根基傳播峨眉武術文化。《峨眉拳譜》一書中曾記載描述“一樹五花，五花八葉扶，皎皎峨眉月，光輝滿江湖。”[4]其中一樹泛指峨眉武術，五花指巴蜀的5個地理區域，即四川省青城山的青城派，金堂云頂山的鐵佛派，四川青牛山的青牛派，四川涪陵點易派以及榮昌、隆昌兩地的黃林派；而八葉則指當今四川武術中普遍認同的僧門、岳門、趙門、杜門、洪門、化門、字門、會門8個著名門派。八葉與《峨嵋拳普》中記載的基本一致，泛指當今巴蜀流傳的趙門、僧門、岳門、杜門四大家以及洪門、化門、字門、會門四小家。

2.3 酪氨酸酶活性測定

參考文獻[6]方法，采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法檢測酪氨酸酶活性，反應混合物與體積見表3，計算酪氨酸酶抑制率。酪氨酸酶抑制率（%）＝[（A475a－A475b）－（A475c－A475d）]/（A475a－A475b）×100%。式中，a為未加中藥的加酶混合液，b為未加中藥和酶的混合液，c為加中藥和酶的混合液，d為加中藥而未加酶的混合液。

表3 反應混合物與體積（mL）

2.4 多巴色素自動氧化生成黑素量測定

將酪氨酸酶試液（135 U/mL）0.5 mL在25 ℃溫育10 min，加入多巴溶液（0.03%）0.5 mL，一起溫育5 min，然后分別加入PBS溶解的受試物0.5 mL（500、200、50 μg/mL）并溫育60 min，加入1 mol/L鹽酸2 mL終止反應，將該混合物于3000 r/min離心15 min，沉淀物分別用6 mol/L鹽酸1 mL洗1次、雙蒸水洗2次，然后用1 mol/L NaOH溶液2 mL充分溶解離心團塊，用分光光度計在400 nm處測定吸光度（OD值）。以黑素量為橫坐標，OD值為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程＝5.1＋0.47（＝0.999 9）。結果表明黑素量在0～160 μg/mL范圍內OD值與黑素量呈良好的線性關系。通過黑素標準曲線計算各組方黑素生成量。

2.5 多巴自動氧化反應測定

將3 mL多巴溶液（0.03%）和3 mL PBS稀釋過的受試物（50、10、2 mg/mL）混合，在空氣中（25 ℃）暴露4 d，然后用分光光度計在475 nm處測定OD值，以PBS代替受試物作為空白對照，計算各組方對多巴自動氧化反應的抑制作用。

2.6 解析組方中主效應中藥

采用SPSS16.0統計軟件，指標測定結果以±表示，析因分析采用檢驗，＜0.05表示差異有統計學意義，分別解析祛斑中藥中抑制酪氨酸酶活性、多巴色素自動氧化生成黑素量、抗多巴自動氧化反應的主效應、交互效應、單獨效應。

3 結果

3.1 各組方對黑素合成的影響

各組方干預黑素合成各指標測定結果見表4。

3.2 酪氨酸酶活性抑制率析因分析

各組方酪氨酸酶活性抑制率析因分析結果顯示，A、B、C因素兩兩交互效應中2條直線均相互平行，說明因素間不存在交互作用，即組方對酪氨酸酶的抑制不存在交互效應，故只需考慮各因素的主效應作用。由檢驗結果（見表5）可知，C＞B＞A，其中C因素有統計學意義（＜0.05），B、C因素無統計學意義（＞0.05）。可見，C因素（山萸肉）的貢獻遠大于A因素（山楂）、B因素（當歸），處于絕對主導地位，尤以山萸肉水平2對酪氨酸酶活性具有顯著抑制作用，是復方中酪氨酸酶活性抑制的主效應中藥。

表4 各組方干預黑素合成結果

表5 酪氨酸酶抑制率析因方差分析表

3.3 多巴色素自動氧化生成黑素含量析因分析

多巴色素自動氧化生成黑素含量析因分析結果顯示，A、B、C因素兩兩交互效應中2條直線均相互平行，說明因素間不存在交互作用，即組方抑制多巴色素自動氧化生成黑素量不存在交互效應，故只需考慮各因素的主效應作用。由檢驗結果（見表6）可知，B＞C＞A，其中B、C因素有統計學意義（＜0.05），A因素無統計學意義（＞0.05）。B因素（當歸）、C因素（山萸肉）的貢獻遠大于A因素（山楂），處于絕對主導地位，其中當歸水平1、山萸肉水平2對多巴色素自動氧化生成黑素量的抑制明顯，是復方中抑制多巴色素自動氧化生成黑素量的主效應中藥。

表6 多巴色素自動氧化生成黑素量析因方差分析表

3.4 抗多巴自動氧化反應析因分析

多巴自動氧化反應抑制試驗析因分析結果顯示，A、B、C因素兩兩交互效應中AC因素、BC因素2條直線相互不平行，說明兩因素可能存在交互作用，即組方對多巴自動氧化的抑制存在交互效應，故需考慮交互作用。由檢驗結果（見表7）可知，B＞C＞A×C＞A＞B×C，其中B、C因素有統計學意義（＜0.05），A、A×C、B×C因素無統計學意義（＞0.05）。可見，C因素與A、B因素存在交互作用，但無顯著影響，故主要分析主效應中藥。C因素（山萸肉）、B因素（當歸）的貢獻遠大于A因素（山楂），處于絕對主導地位，尤以當歸水平2、山萸肉水平1對多巴自動氧化具有顯著抑制作用，是復方中抗多巴自動氧化反應的主效應中藥。

表7 抗多巴自動氧化反應析因方差分析表

4 討論

色素增多性皮膚病臨床最常見的有黃褐斑、老年斑、雀斑等，屬中醫學“黧黑斑”“面塵”“面黑皯”等范疇。目前中西醫尚無具有確切療效的良藥。“氣血失和，不能榮于面部皮膚而生色斑”（《本草綱目》），臨床選藥當辨證論治。祛斑中藥組方是本課題組治療色素增多性皮膚病的常用驗方，方中當歸、山楂、山萸肉等滋補肝腎、養血活血，臨床治療黃褐斑療效確切，前期研究亦證實山楂、當歸、山萸肉等藥（“斑白”搽劑主成分）高、中、低3個不同濃度對酪氨酸酶活性均有很強的抑制作用[1-3]。因而，本研究根據中醫理論及前期研究結果，繼續采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法檢測酪氨酸酶活性，并運用數學模型“析因設計法”剖析方中具有抑制酪氨酸酶活性的主效應中藥，結果表明各藥的酪氨酸酶活性抑制率依次為山萸肉＞當歸＞山楂，山萸肉的貢獻處于絕對主導地位，對酪氨酸酶活性具有顯著抑制作用（＜0.05），是方中酪氨酸酶活性抑制的主效應中藥。

祛斑中藥組方臨床治療色素增多性皮膚病的優勢為其作用的多途徑、多環節，不能單靠酪氨酸酶活性抑制模型來篩選脫色劑，還應根據色素生成的許多環節進行綜合評價[7-8]。黑素生成過程是一個較為復雜的過程，該過程除與酪氨酸酶相關外，還與多巴色素自動氧化、多巴自動氧化等因素密切相關。因此，本研究進行了多巴色素自動氧化生成黑素、多巴自動氧化試驗的研究，以深入剖析祛斑中藥干預黑素合成的主效應中藥。結果顯示，各藥對多巴色素自動氧化生成黑素的抑制作用依次為當歸＞山萸肉＞山楂，當歸、山萸肉的貢獻處于絕對主導地位，對多巴色素自動氧化生成黑素具有明顯抑制作用（＜0.01），是方中抑制多巴色素自動氧化生成黑素的主效應中藥；各藥對多巴自動氧化反應的抑制依次為當歸＞山萸肉＞山楂×山萸肉＞山楂＞當歸×山萸肉，當歸、山萸肉的貢獻處于絕對主導地位，對多巴自動氧化的抑制明顯（＜0.05），是方中抑制多巴自動氧化的主效應中藥。

中藥復方的效果是多靶點、多途徑、多系統藥理效應的綜合表現。本研究在前期實驗基礎上采用析因設計與藥效相結合的方法，進一步明確了祛斑中藥在治療色素增多性皮膚病方面的主效應中藥或組合，研究結果從某種程度上印證了這一理論。正是由于中藥復方具有多靶點、多途徑、多系統的作用特點，必然存在不同作用途徑的主要中藥，圍繞這一思路，采用析因設計法逐步明晰中藥復方綜合作用的物質基礎，對于中藥復方配伍的現代詮釋具有重要意義。

[1] 張理平,張海燕,李孝棟,等.28味中藥酸性成分提取物影響黑素合成的實驗研究[J].中華中醫藥雜志,2009,24(11)：1443-1445.

[2] 陳志春,王英豪.地骨皮總黃酮的提取及酪氨酸酶活性抑制研究[J].福建中醫藥,2012,43(4)：54-56.

[3] 張理平.“斑白”搽劑中微量元素與氨基酸的含量及祛斑機理[J].光明中醫,2004,19(6)：57-58.

[4] 張理平,陳麗,胡筱,等.外用中藥斑白搽劑對黑色素產生過程中酪氨酸酶的抑制作用[J].中國臨床康復,2005,9(10)：168-169.

[5] 胡良平,郭辰儀.用SAS軟件實現析因設計定量資料的統計分析[J].藥學服務與研究,2011,11(3)：170-173.

[6] 王英豪,陳志春,張理平,等.響應面法優化桑椹黃酮超聲輔助提取工藝及對酪氨酸酶活性抑制研究[J].中國中醫藥信息雜志,2016,23(2)：93-97.

[7] 張海霞,梁乃龍.黃褐斑與酪氨酸酶活性的相關性研究[J].遼寧中醫藥大學學報,2010,12(9)：99-100.

[8] 鄒宏超,付香蓮.黃褐斑病因及發病機制研究進展[J].皮膚病與性病, 2010,32(4)：27-29.

Research on Main Effective Chinese MateriaMedica inPrescription for Intervention in Melanin Synthesis

CHEN Zhi-chun1, WANG Ying-hao2, ZHANG Li-ping2, LAN Ming-jin2

Objective To investigate the major effective Chinese materia medica inPrescription for intervention in melanin synthesis. Methods 3×2 factorial design was used. The factors of investigation were Crataegi Fructus, Angelicae Sinensis Radix and Corni Fructus. Tyrosinase activity, melanin generation and auto-oxidation of dopa were determinated respectively; and the major effective Chinese materia medica ofPrescription for intervention in melanin synthesis was analyzed by SPSS16.0 software. Results Tyrosinase activity was remarkably inhibited by Corni Fructus (<0.05). Melanin generation was remarkably inhibited by Corni Fructus and Angelicae Sinensis Radix (<0.01). Auto-oxidation of dopa was remarkably inhibited by Corni Fructus and Angelicae Sinensis Radix (<0.05). Corni Fructus was in an absolute leading position. Conclusion Corni Fructus is the major effective Chinese materia medica in inhibiting tyrosinase activity, melanin generation and auto-oxidation of dopa in the prescription.

factorial design; tyrosinase; melanin;Prescription; effective Chinese materia medica

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.07.020

R285.5

A

1005-5304(2017)07-0086-04

福建省自然科學基金（2013J01377）

王英豪，E-mail：wyhtcm@aliyun.com

（2016-11-16）

（2016-12-09；編輯：陳靜）