谷氨酸鈉肥胖大鼠下丘腦腹內、外側核胃動素的表達研究

陳魯曼+段旭艷+關真民

[摘要] 目的 研究谷氨酸鈉誘導的肥胖大鼠下丘腦腹內側核區和腹外側核區胃動素陽性細胞的表達情況。方法 2014年11月—2015年6月期間從山東魯抗制藥有限責任公司購買60只剛出生的雄性Wistar大鼠隨機平分為實驗組和對照組（各30只），在第2、4、6、8、10天分別皮下注射等量谷氨酸鈉和生理鹽水。大鼠飼養至90 d時，取下丘腦行免疫組化染色，觀察胃動素在下丘腦腹內側核區、腹外側核區的表達情況。結果 實驗組有29只大鼠呈肥胖狀態，顯示谷氨酸鈉誘導大鼠有98%因能量失衡呈肥胖狀態；同時免疫組化評分顯示：實驗組和對照組的腹內側核區、腹外側核區陽性細胞率和中位數分別為（2.68±1.61）和2.12、（4.79±2.92）和4.67、（1.52±1.31）和1.44、（2.14±1.13）和1.62，實驗組腹內側核和腹外側核胃動素陽性細胞與對照組相比均明顯增加，差異有統計學意義（P<0.05）；實驗組腹外側核比腹內側核胃動素陽性細胞增加明顯，差異有統計學意義（P<0.05）；對照組大鼠下丘腦腹內側核和腹外側核胃動素陽性細胞之間差異無統計學意義（P>0.05）。結論 谷氨酸鈉誘導的肥胖大鼠可以引起下丘腦腹內側核區、腹外側核區胃動素的表達增強。

[關鍵詞] 谷氨酸鈉；胃動素；下丘腦；肥胖大鼠

[中圖分類號] R966 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）05（a）-0034-04

[Abstract] Objective To study on expression of motilin in ventromedial and lateral nucleus of hypothalamus of rat obesity？induced by glutamic sodium.Methods In November 2014 to June 2015 from shandong anti-lu pharmaceutical co.， LTD buy 60 newborn male Wistar rats randomly divided into experimental group and control group （30），on day 2，4，6，8，10 respectively were injected with normal saline and sodium glutamate.The 90 day， hypothalamus were performed immunohistochemical staining， observe the expression of motilin in hypothalamus of intra-abdominal， lateral nucleus. Results 29 only the experimental group rats were obese，Monosodium glutamate induced by 98% because of the energy imbalance in obese rats； And Immunohistochemical score shows： the experimental group and control group in the ventromedial nucleus， ventral lateral nucleus positive cell rate and the median was （2.68±1.61） and 2.68， respectively， （4.79±2.92） and 2.92， （1.52±1.31） and 1.31， （1.14±1.13） and 1.13， the ventromedial nucleus and ventrolateral experimental gastric dynamic element positive cells were significantly increased compared with control group， the difference statistically significant （P<0.05）； Experimental ventrolateral nucleus than the ventromedial nucleus gastric positive cells significantly increased， the difference statistically significant （P < 0.05）； Control the ventromedial nucleus in the rat hypothalamus and ventral lateral nucleus gastric dynamic element difference between positive cells has no statistical significance （P>0.05）. Conclusion It suggested that The obese rats induced by sodium glutamate can cause gastric dynamic element expression of hypothalamus.

[Key words] Glutamate；motilin； Hypothalamus； Obese rats

胃動素 （motilin，MTL）是由腸嗜鉻細胞分泌的一種含有22種氨基酸的直鏈多肽，主要功能是促進胃腸運動，同時刺激胃蛋白酶的分泌[1]。近年來發現，MTL不但存在于消化系統，還存在于中樞神經系統，屬于腦-腸肽的范疇。目前，國內探討了胃動素在中樞神經系統各腦區的表達[2-3]，發現其受體廣泛分布于腦內多個核團，在記億、情緒、食欲、進食等方面可能起著廣泛的調節作用，谷氨酸鈉肥胖大鼠模型是單純性肥胖的經典動物模型，但目前對谷氨酸鈉作用肥胖大鼠中樞神經系統的具體機制還不十分清楚。該文擬通過2014年11月—2015年6月期間從山東魯抗制藥有限責任公司購買60只剛出生的雄性Wistar大鼠為研究對象，研究谷氨酸鈉肥胖大鼠的下丘腦腹內側核和腹外側核區中胃動素陽性細胞表達特點進行研究，從而揭示下丘腦型肥胖大鼠胃動素陽性細胞表達的分布特點，為谷氨酸鈉誘導的肥胖大鼠模型的形成機制提供理論依據，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 肥胖模型制作

新生Wistar大鼠60只，雄性，體重（48.14 ±6.70）g，合格證號：scxk（魯）2014-0006。按照隨機平均原則分為實驗組和對照組，各30只。在第2、4、6、8、10天分別給實驗組大鼠皮下注射谷氨酸鈉，對照組皮下注射等量生理鹽水，3 mg/g體重，共5次。飼養至滿月后進行斷奶，飼養期間兩組均給予常規飼料和水，一直持續8周時間，每天測量所有Wistar大鼠的體重及體長，并做好實驗記錄。然后根據Lee指數進行篩選計算，挑選出符合實驗標準的Wistar大鼠。實驗組肥胖大鼠和對照組正常大鼠各26只。

1.2 動物取材

所有合格大鼠均于出生后90 d時，斷頭取材。用10%的水合氯醛（國藥準字H37022673）3 mL/kg行腹腔注射麻醉后，打開暴露大鼠的胸腔， 經左心室穿刺至主動脈，先用500 mL生理鹽水沖洗，再用500 mL多聚甲醛（40 g/L）經升主動脈緩慢灌注，大約2 h。選擇兩組中灌注相對較好的實驗大鼠各22只，采用斷頭開顱取下丘腦組織，取出后先用生理鹽水進行沖洗，之后再用多聚甲醛（國藥準字Z20090250）40 g/L固定8 h后，在20%蔗糖溶液中進行脫水，包埋。

1.3 ABC法免疫組化染色

利用Koning等的大鼠腦定位圖譜，從大鼠下丘腦的腹內側核和腹外側核隆起所在的平面進行切片。該實驗采用恒冷箱切片，間隔取片，切片厚約20 μm，每例共取5張。染色中所用抗體濃度MTL（1∶500）。染色具體步驟：冰凍切片用PBS漂洗約2 min，共3次；3%H2O2室溫約10 min，再用PBS漂洗約2 min，共3次； 加15mL/ L封閉血清，室溫孵育約30 min ，棄去血清不清洗，再加入MTL-R抗體（1∶500），在4℃進行孵育約24 h；取出之后室溫放置2 h后，再用PBS漂洗3次；免疫組化染色陰性對照組用PBS代替第2抗體，其余步驟不變。

1.4 實驗結果觀察

免疫組化染色MTL-R陽性細胞的判定標準：陽性細胞表現為細胞核和細胞質不著色，細胞膜著黃色或棕黃色的細胞。統計時每1張染色切片高倍鏡選取5個視野，采用二級計分的方法，按染色深淺評分：無著色計0分，淡黃色計1分，棕黃色或棕褐色計2分；再按照陽性細胞比例進行評分：無陽性細胞者計0分，25%陽性細胞者計1分，26%～50%陽性細胞者計2分，51%以上者計3分。最后將二者得分相加，就是綜合免疫組化的最終評分：0定為陰性（-），1～2分為陽性（+），3～5分為強陽性（++）。

1.5 統計方法

對實驗結果行應用SPSS 11.5統計學軟件統計分析，各組計量以均數±標準差（x±s）表示，先行單因素方差分析，方差齊性檢驗后行配對LSD檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗組谷氨酸鈉肥胖大鼠和對照組下丘腦腹內側核、腹外側核胃動素的表達情況

免疫組化染色結果顯示：神經元細胞陽性表現為細胞核和細胞質不著色，細胞膜著黃色或棕黃色的細胞；部分神經纖維也呈陽性反應。實驗組和對照組下丘腦腹內側核和腹外側核區均有陽性細胞出現，并且同區實驗組陽性細胞均比對照組的陽性細胞有明顯增多；陰性對照片結果陰性。見圖1。

2.2 實驗組谷氨酸鈉肥胖大鼠和對照組下丘腦腹內側核、腹外側核胃動素陽性細胞率的比較

實驗組谷氨酸鈉肥胖大鼠下丘腦腹內側核和腹外側核胃動素陽性細胞與對照組相比均明顯增加，差異有統計學意義（P<0.05）；實驗組谷氨酸鈉肥胖大鼠下丘腦腹外側核比腹內側核胃動素陽性細胞增加明顯，差異有統計學意義（P<0.05）；對照組大鼠下丘腦腹內側核和腹外側核胃動素陽性細胞之間差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

3 討論

隨著經濟水平的不斷提高，人們的生活和醫療條件也在不斷改善，老齡化程度也在進一步加重，更多的老年性疾病患者出現，其中最突出的老年性疾病是肥胖，研究發現肥胖癥兒童發病率逐年增加是造成青少年無癥狀轉氨酶增高的主要原因，部分可以轉化為肝纖維化和肝硬化，甚至終末期肝病肝纖維化為病程發展的重要環節[4]，肥胖已經演變為現代社會生活的一種流行病。據統計我國的肥胖發病率已經從2002年的7.1%逐步上升到了11.9%[5]，肥胖已經成為一種嚴重的公共健康問題。肥胖癥（adiposity）是一組由于攝食和能量調節紊亂引起的慢性代謝性疾病癥候群[6]，因肥胖癥引起的糖尿病、高血壓病、惡性腫瘤、不孕不育等正呈現逐年遞增的趨勢。因此，肥胖已經成為影響人類健康的最主要的危險因素之一。但是對肥胖及其相關性疾病的產生機制以及防治措施的研究還處于初級階段。尤其對于肥胖癥患者的食欲中樞調節機理成為目前研究的熱點問題，目前比較成熟的動物模型是谷氨酸鈉肥胖大鼠模型，谷氨酸鈉肥胖大鼠的產生機制可能是與下丘腦弓狀核神經肽Y的表達活性增強有關，神經肽Y活性超表達可以積極促進大鼠機體脂肪組織的生成增加，從而引起下丘腦神經細胞分泌瘦素顯著增加[3]。近幾年研究證明很多肽類激素都已經被歸屬為肥胖相關肽，但MTL對攝食及體重的影響目前還沒有公認的研究結論。

MTL作為一種腦-腸肽，在中樞神經系統的功能和作用的研究已經取得了一些成果：王洪忠等[7]研究發現胃動素可通過抑制大鼠下丘腦 PVN 神經元細胞電壓依賴性鉀電流，發揮其增強胃腸運動的作用。胃動素受體在中樞神經系統廣泛分布，尤其是與攝食、記憶、學習等功能研究有關。張梅等[8]研究發現阿奇霉素促進胃排空的機制可能為小劑量下僅為胃動素樣作用；中劑量、大劑量時除胃動素樣作用外，有內源性胃動素參與。因而研究谷氨酸鈉肥胖大鼠的中樞調節機制和胃動素表達意義重大。

該實驗結果實驗組有29只大鼠呈肥胖狀態，顯示谷氨酸鈉誘導大鼠有98%因能量失衡呈肥胖狀態，與之前劉銘瑤等[9]研究的谷氨酸鈉造模大鼠的體重、Lees指數（（體重/g）1/3×103/體長/cm）、腹部脂肪質量顯著高于同期正常對照組（P<0.01），提示大鼠造模成功的結果相一致。并且免疫組化的結果也證實實驗組的肥胖大鼠在中樞神經系統的下丘腦腹內側核和腹外側核區胃動素陽性細胞數量明顯增多，實驗組和對照組的腹內側核區、腹外側核區陽性細胞率和中位數分別為（2.68±1.61）和2.12、（4.79±2.92）和4.67、（1.52±1.31）和1.44、（2.14±1.13）和1.62，實驗組腹內側核和腹外側核胃動素陽性細胞與對照組相比均明顯增加，差異有統計學意義（P<0.05）；實驗組腹外側核比腹內側核胃動素陽性細胞增加明顯，差異有統計學意義（P<0.05）；對照組大鼠下丘腦腹內側核和腹外側核胃動素陽性細胞之間差異無統計學意義（P>0.05）。這些實驗結果都說明胃動素受體被激活以后，可能直接作用于攝食相關中樞，使大鼠增加攝食； 胃動素還有可能作為一種神經遞質通過神經-體液調節機制，增加胃腸動力，縮短胃腸排空時間，增加其饑餓感，使攝食增多。這與劉梅等[10]對動物的側腦室注射胃動素后使其進食量大量增加，可能與這些動物神經中樞的胃動素受體有關的結論相一致。

綜上所述，這些結果提示谷氨酸鈉誘導大鼠肥胖的原因可能跟下丘腦腹內側核、腹外側區胃動素陽性細胞表達增加有密切關系。谷氨酸鈉可以誘導大鼠的這兩個區域的胃動素受體數量增加，胃動素受體一旦被激活，大鼠食欲就會加大，體重隨之增加。但對于下丘腦的其它核區是否還有胃動素陽性細胞表達的改變，還需要進一步研究，為肥胖癥的治療和藥物開發提供理論依據。

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（收稿日期：2017-02-04）