血漿miR-152-3p作為肺癌診治指標的臨床價值

陳望，劉和錄，劉瓊，徐志康，汪奇云，於艷霞

(廣州醫科大學附屬深圳沙井醫院檢驗科，廣東深圳518104)

血漿miR-152-3p作為肺癌診治指標的臨床價值

陳望，劉和錄，劉瓊，徐志康，汪奇云，於艷霞

(廣州醫科大學附屬深圳沙井醫院檢驗科，廣東深圳518104)

目的探討血漿中miR-152-3p濃度相對水平在肺癌早期診斷中的應用價值。方法采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測我院和廣州醫科大學呼吸疾病研究所收集的2014年5～10月55例Ⅰ、Ⅱ期肺癌患者和53例健康人群血漿中miR-152-3p濃度相對水平，并對檢測結果進行統計學分析，比較兩組結果之間是否存在差異性，同時運用ROC曲線分析評價miR-152-3p對肺癌早期診斷的價值。結果肺癌患者血漿中miR-152-3p濃度相對水平為(4.71±2.18)，健康組為(7.34±4.15)，肺癌患者明顯低于健康組，差異有統計學意義(t=4.223，P＜0.05)；血漿miR-152-3p濃度ROC曲線下面積(AUC)為0.689；當血漿中miR-152-3p濃度相對水平在最佳臨界值5.6時，血漿miR-152-3p對肺癌診斷的特異性為67.3%，敏感性為62.3%；不同年齡、性別、吸煙和不吸煙、I期和II期肺癌患者血漿中miR-152-3p濃度相對水平比較差異均無統計學意義(P＞0.05)。結論肺癌患者血漿中miR-152-3p濃度相對水平明顯低于健康人群，但對肺癌早期診斷的準確性較低，需結合其他生物標記物聯合檢測。

肺癌；miR-152-3p；逆轉錄定量PCR技術；診斷

近50年來肺癌發病率顯著增高，居目前全世界癌癥死因的首位，而且預后較差[1-2]。肺癌的發生發展是一個復雜的、多步驟和多因素的過程，早期一般無癥狀，大多數患者確診肺癌時已多是晚期(Ⅲ期或Ⅳ期)。在未來40～50年肺癌將是構成人類健康最大威脅的疾病[3]。因此，國內外學者一直致力于尋找新的腫瘤生物標志物來用于肺癌的早期診斷、個體化治療及預后判斷。

microRNAs(miRNAs)是一類不編碼蛋白質，單鏈的小RNA，由19～30個核苷酸組成。自從1993年被發現以來，miRNAs在細胞功能調控的多方面發揮著重大的作用[4-5]。近期研究顯示miRNAs的特異性表達與腫瘤的發生和發展有關，其中一些miRNA呈現出促癌或抑癌作用[6]。也有研究結果顯示血漿中miRNAs有可能成為肺癌早期診斷的新生物標志物，為肺癌的早期臨床診斷、治療和預后判斷提供可靠的科學依據[7-9]。本研究以外周靜脈血為檢測標本，通過相應循環血漿RNA提取技術和RT-qPCR技術檢測肺癌患者血漿中miR-152-3p濃度相對水平來探討其在肺癌早期診斷中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2014年5～10月期間來我院和廣州醫科大學呼吸疾病研究所就診的肺癌患者55例，其中男性31例，女性24例；年齡31～81歲，平均(60.71±10.62)歲。所有患者均經病理學確診為肺癌新發病例，其中小細胞型肺癌10例，非小細胞型肺癌45例。標本采集前一年內沒有放射治療和外科手術治療，病案跟蹤至少兩年。對照組53例健康人群均來自干部體檢人群，男性24例，女性29例；年齡44～91歲，平均(57.11±12.09)歲。確保兩組研究對象的年齡、性別等一般資料差異無統計學意義(P＞0.05)。

1.2 儀器與試劑SLAN-96P型PCR分析儀由上海宏石醫療科技有限公司提供；ABI step one plus熒光PCR分析儀由美國ABI公司提供；血漿miRNA提取試劑盒miReasy Mini Kit，miRNA逆轉錄的miScript Reverse Transcription Kit和實時熒光定量PCR試劑盒miScript SYBR Green PCR Kit均由德國Qiagen公司提供；miR-152-3P定量PCR引物序列為TCAGTGCATGACAGAACTTGG。

1.3 方法

1.3.1 標本收集所有研究對象均采用一次性真空采血管采集靜脈血5.0 mL于EDTA-K2抗凝管內，混勻離心分離血漿，吸500 μL血漿于1.0 mL冷凍管內置于-80℃低溫保存。

1.3.2 循環血漿microRNA提取取400 μL低溫冷藏的血漿樣本，加入5倍體積的QIAzol試劑，置于冰上融化，充分混勻。放置室溫5 min，加入等體積100%氯仿，振蕩混勻，室溫放置2～3 min，4℃，12 000 g離心15 min，取上層水相300 μL轉移至新的離心管中，取加入1.5倍體積100%乙醇，充分混勻。按miReasy Mini Kit的操作手冊用吸附柱提取RNA。用30 μL的RNease-free water溶解RNA，置于-80℃低溫冰箱保存。為將RNA提取效率及PCR數據標準化，在每個提取標本中加入25 fmol的合成線蟲miR-54 (Cel-miR-54)。

1.3.3 實時熒光定量PCR檢測miR-152-3p取15 μL RNA樣本，4 μL Buffer RT，1 μL Mix，up to 20 μL，使用miScript Reverse Transcription Kit試劑盒于PCR儀上進行miRNA的逆轉錄cDNA。反應條件為：37℃1 h，95℃5 min。qPCR反應按miScript SYBR Green PCR Kit試試劑盒操作說明書進行，反應體系：miScript SYBR Green Mix 10 μL，PCR正向和反向引物各0.4 μL，模板cDNA 1 μL，加滅菌蒸餾H2Oμp to 20 μL。在ABI step one plus熒光PCR儀中進行擴增。反應條件為：95℃15 min；94℃30 s，55℃15 s，70℃30 s進行40個循環。每份cDNA均在相同條件下進行miR-152-3p的檢測，設立重復實驗和陰性對照實驗，所有樣本重復3次，陰性對照以DEPC H2O代替模板cDNA。

1.3.4 miRNA-152-3p濃度相對水平計算濃度相對水平(Re)采用比較CT法定量，計算方法為2-△△CT法，計算公式為△CTc=CTc目-CTc內，△CTn=CTn目-CTn內(c為肺癌組，n為對照組)。濃度相對水平進行對數(log2Re=-△CT)處理后，計算miRNA-152-3p基因的起始模板量從而反映出miRNA-152-3p基因的濃度相對水平。

1.4 統計學方法應用SPSS18.0統計軟件進行數據分析，計量數據以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。應用SPSS18.0軟件制作miRNA-152-3p的受試者ROC曲線圖，以ROC曲線來分析miRNA-152-3p對早期肺癌的診斷價值。

2 結果

2.1 血漿中miR-152-3p濃度相對水平肺癌患者血漿中miR-152-3p濃度相對水平為(4.71±2.18)，對照組為(7.3415±4.15)，肺癌患者明顯低于對照組，差異有統計學意義(t=4.223，P＜0.05)。

2.2 血漿中miR-152-3p濃度相對水平的ROC曲線分析對血漿中miR-152-3p濃度相對水平運用SPSS18.0軟件進行ROC曲線分析，miR-152-3p濃度相對水平曲線下面積(area under the ROC curve，AUC)為0.689(95%置信區間CI為0.589～0.789)。當血漿中miR-152-3p濃度相對水平為最佳臨界值5.6時，血漿中miR-152-3p對肺癌早期診斷的特異性為67.3%，敏感性為62.3%，見圖1。

圖1 血漿miR-152-3p濃度相對水平的ROC曲線

2.3 不同臨床病理特征肺癌患者血漿中miR-152-3p濃度相對水平不同年齡、性別、吸煙和不吸煙、Ⅰ期和Ⅱ期肺癌患者血漿中miR-152-3p濃度相對水平比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 不同臨床病理特征肺癌患者血漿中miR-152-3p濃度相對水平比較

3 討論

MiRNA是一類內生的、長度18～25個核糖核苷酸的非編碼小分子RNA，通過與靶標基因完全或不完全配對結合后，抑制靶標基因mRNA翻譯或降解靶標基因mRNA，從而在轉錄后調控蛋白的表達，參與細胞生命活動，與機體的生長發育、應激反應及凋亡等密切相關[10]。隨著生命科學的發展，越來越多的miRNA被發現，miRNA特異性表達與癌癥發生發展的相關性是目前的熱點[11]。近期研究表明，多種miRNA參與了癌細胞重要生物程序的調控，發揮了抑癌基因或促癌基因的功能，在腫瘤的發生和發展中起了重要的作用，且miRNA在腫瘤的診斷、治療及療效判斷中作用也越來越受到重視[12]。

腫瘤患者和正常健康人群的組織、血漿和血清中MiRNAs水平表達存在差異性。Chen等[13]采用Solexa測序法對健康人和非小細胞肺癌患者血清的miRNAs分析結果顯示，兩組血清中miRNA分子譜存在明顯差異性，健康人群檢出28種miRNA，而肺癌患者未檢出，但檢測出了63種健康人群沒有的miRNA；Mitchell等[14]研究結果也顯示，miRNAs在血漿或血清中以非常穩定的形式存在，且能夠抵抗RNA酶的降解，這提示血漿或血清中miRNAs可以作為足夠穩定的生物學標記物被加以臨床應用。

MiRNA還被發現可能成為新的肺癌早期診斷和癌癥進程相關的標志物，有助于肺癌的早期診斷、個性化治療及預后判斷[15]。其被發現在某些常見腫瘤如肺癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌及直腸癌的發生發展過程起到重要的作用，為腫瘤的早期診斷、治療、預后判斷提供了可靠的依據和新的研究方向。本研究結果顯示，肺癌患者血漿中miR-152-3p濃度相對水平顯著低于健康人群組，差異有統計學意義(P＜0.05)，這可能表明miR-152-3p有抑癌作用，而不同年齡、性別、吸煙和不吸煙、Ⅰ期和Ⅱ期肺癌患者血漿中miR-152-3p濃度相對水平之間差異均無統計學意義(P＞0.05)。

通過對血漿miRNA-152-3p濃度相對水平進行ROC曲線分析，發現miRNA-152-3p濃度相對水平ROC曲線下面積為0.689。根據報道可知，ROC是一種全面和準確評價腫瘤標志物在臨床診斷應用的非常有效的方法，AUC在0.5～0.7時為有較低的準確性[16]。當miR-152-3p濃度相對水平取最佳臨界值5.6時，血漿中miR-152-3p對肺癌早期診斷的特異性和敏感度分別為67.3%和62.3%。

綜上所述，血漿中miR-152-3p濃度相對水平對肺癌早期診斷的價值較低，其作為肺癌單獨診斷指標存在不足，如果能聯合少數其他循環血漿中miRNA指標來提高診斷的特異性和敏感度，對腫瘤早期診斷具有更廣闊的應用前景，同時為肺癌的早期診斷提供新的、可靠的檢查方案，以達到肺癌早診斷和早治療的目的，對患者預后康復、提高患者生存率及生活質量具有重要意義。

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Clinical value of plasma miR-152-3p in early diagnosis of lung cancer.

CHEN Wang,LIU He-lu,LIU Qiong,XU Zhi-kang,WANG Qi-yun,YU Yan-xia.
Department of Clinical Laboratory,Shenzhen Shajing Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University,Shenzhen 518104,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo explore the application value of plasma miR-152-3p in the early diagnosis of lung cancer.MethodsmiR-152-3p levels were detected in 55 patients with stageⅠ,Ⅱlung cancer and 53 healthy adults (healthy group)in plasma in our hospital and Institute of Respiratory Diseases,Guangzhou Medical University from May 2014 to October 2014 by real-time fluorescence quantitative-PCR(RT-qPCR).The test results were statistically analyzed.The differences between the two groups were compared.Receiver operating characteristic(ROC)curves were used to evaluate the value of miR-152-3p in the early diagnosis of lung cancer.ResultsThe miR-152-3p relative levels in plasma of lung cancer patients was(4.71±2.18),which was significantly lower than(7.34±4.15)in healthy group (t=4.223,P＜0.05).The area under the ROC curve(AUC)of the plasma miR-152-3p concentration was 0.689.When the concentration of miR-152-3p in plasma was at the optimum critical value of 5.6,and the specificity of plasma miR-152-3p in diagnosis of lung cancer was 67.3%,with the sensitivity of 62.3%.There were no statistically significant differences in plasma miR-152-3p concentrations between patients with different age,sex,smoking and non-smoking, stageⅠand stageⅡlung cancer(P＞0.05).ConclusionRelative concentration of miR-152-3p in plasma of patients with lung cancer is significantly lower than that of healthy people,but its accuracy for early diagnosis of lung cancer is low,which should be detected in combination with other biomarkers.

Lung cancer;miR-152-3p;Reverse transcription quantitative PCR technique(RT-qPCR);Diagnosis

R734.2

A

1003—6350（2017）12—1959—03

2016-11-04)

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.12.022

深圳市寶安區科技項目(編號：2014202)

陳望。E-mail：195269566@qq.com